[发明专利]一种防治蔬菜真菌病害微生物农药的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及植物内生真菌防治部分蔬菜真菌病害有效菌株的分离，及其抑菌代谢产物的制备与应用方法。

背景技术

植物体内都存在大量的内生真菌，内生真菌最早发现于牧草，后来又在木本植物、草本植物、禾本植物、苔藓、地衣、海藻等植物中被发现。迄今的研究表明，植物内生真菌可增强宿主的抗病性、提高植物的生产力、抗逆抗虫等。发挥这些作用是由于内生真菌在植物体内繁殖和生长，并在体内产生有生物活性的次生代谢产物。因此，内生真菌可能成为生物防治中有潜力的生物控制剂，在生态农业和生物农药研制方面具有重要的用途。近年来植物内生真菌已引起了微生物学家、生态学家、植物保护学家的广泛兴趣，逐渐成为国内外研究的热点。目前微生物源生物化学农药的研究和开发在我国十分活跃，但微生物资源及其应用潜力尚没有得到充分的发挥，而植物内生真菌即是这样一类有待开发的新兴微生物资源。

枸骨(Ilex cornuta Lindl.et Paxt.)为冬青科常绿植物，主要分布于河南、湖北、湖南、安徽、江苏、浙江、江西、福建等地。枸骨叶味苦、微涩，性寒，是一种中药，始载于《本草拾遗》。传统中医药理论认为，枸骨叶具有清热养阴，平肝益肾，散风通络等功效；近代药理研究表明，枸骨叶具有抗生育，扩张冠状动脉，抗菌等作用。众所周知，雷公藤具有多种医药作用，从雷公藤中提取的化学成分具有抗肿瘤、抗炎、免疫抑制及抗生育作用，还有治疗类风湿性关节炎等作用。同样雷公藤也是一种良好的杀虫植物，具有胃毒、拒食、抑制生长发育等杀虫活性。D.Siva Sundara Kumar等从雷公藤中筛选到代谢产物具有抗类风湿作用的内生真菌(Journal of Ethnopharmacology，2004，295-300)，申屠旭萍等从雷公藤中筛选到具有对农作物真菌病害具有抑制作用的内生真菌(雷公藤内生真菌的分离及活性菌株的筛选，浙江农业学报，2006，18(5)：308-312)。枸骨作为一种医药植物，已引起研究者广泛兴趣，但它是否也和雷公藤药用植物一样能在防治农作物病虫害中发挥作用，关于这方面的研究还未曾涉足，国内外未见有报道。为了能充分利用天然植物枸骨，发挥其对人类的最大作用，本发明对采自临安天目山的活体枸骨组织进行内生真菌的分离研究，并将所分离到的内生真菌对部分常见蔬菜真菌病害病原菌拮抗活性进行了检测研究，该发明不仅为微生物源农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株同时也为利用枸骨内生真菌的天然活性物质开发农用抗生素提供理论依据和生产参数。

发明内容

本发明的目的是针对化学农药不安全与微生物源农药种类较少的不足，提供一种从枸骨组织内分离筛选出的内生真菌-哈茨木霉菌株L；本发明的另一目的是提供利用该菌株L通过发酵提取其代谢产物制备成防治部分蔬菜真菌病害的微生物农药及其制备方法。

本发明枸骨内生真菌-哈茨木霉菌株L的分离、筛选与鉴定：

是于2006年5月在浙江临安天目山采集的枸骨茎中，经表面消毒、内生真菌的分离、培养和发酵、活性测定以及对抑制蔬菜真菌病害病原菌有效菌株的筛选等步骤获得并保存；经微生物分类学鉴定为哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum Rifai)，定名为哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月14日，保藏登记号CGMCC No.1780。

枸骨内生真菌-哈茨木霉菌株L，其固体培养特征为：菌落在PSA平板上25℃3-4天扩展9cm，初期白色稀疏，菌丝沿培养基表面匍匐生长，后形成黄绿色产孢区。反面无色。菌丝具隔，分枝。

其形态特征为：分生孢子梗形成金字塔式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，4.5-10 x 2.5-3.5μm；

分生孢子球形、近球形，单个近无色，聚集时呈淡灰绿色，壁光滑，直径2.5-3.0μm；厚垣孢子球形、近球形，无色，光滑，直径5.5-7.0μm。

本发明所述的哈茨木霉菌株L，经发酵提取可获得对部分蔬菜真菌病害病原菌具有抑制作用的活性成分倍半萜类化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

一种防治西瓜枯萎病、黄瓜枯萎病、黄瓜立枯病、菜豆炭疽病和番茄早疫病等蔬菜真菌病害微生物农药的制备方法，按以下步骤进行：