[发明专利]一种高活性鸡溶菌酶的基因克隆、表达与应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学制药技术领域，是一种高活性鸡溶菌酶的基因克隆、表达与应用，基因工程重组方法生产鸡溶菌酶的方法。

背景技术

溶菌酶主要存在于动植物的组织液和某些微生物体内，如鼻粘液、眼泪、唾液、卵蛋白、枯草杆菌培养物和某些蔬菜中。该酶能水解细菌的细胞壁中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4-糖苷键，故又称胞壁质酶，即N-乙酰胞壁质糖苷聚糖水解酶。

其中对鸡蛋清溶菌酶的研究最清楚，它是由129个氨基酸残基构成的一种碱性蛋白，分子量约为14KD，对热稳定，对碱不稳定，对革兰氏阳性细菌有较强的杀菌作用。可药用，具抗菌、清除局部坏死组织、止血、消肿、消炎等作用。在食品工业上可用作防腐剂，还可添加在牙膏中作为防治龋齿的药用牙膏。在发酵工业上是一种重要的溶菌剂，用于分解细胞壁，制备无菌体提取液。

目前，从鸡蛋清提取溶菌酶以及从霉菌中提取溶菌酶均已达工业化生产水平，市场销售的溶菌酶大多来源于鸡蛋蛋清中工业化提取的，价格较高。但随着国内外需求量的增大，市场上溶菌酶供不应求；同时溶菌酶的生产也受到原材料的限制，无法满足市场上溶菌酶的需求。因此，提高溶菌酶的产量与活性是一个急需解决的重要问题。

发明内容

本发明的目的正是为了克服上述技术的不足，而提供了一种高活性鸡溶菌酶的基因克隆、表达与应用，通过发酵大批量生产溶菌酶的方法，本方法生产的溶菌酶是在筛选多种鸡蛋溶菌酶的基础上，获得了高生物活性、高表达的溶菌酶基因。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案。这种DNA分子，它编码具有鸡溶菌酶蛋白活性的多肽核苷酸序列，多肽核苷酸序列如附图1所示，载体含有上述的DNA序列。本发明采用真核表达载体pPIC6αA、pGAPZαA与毕赤酵母宿主菌X-33进行重组鸡蛋清溶菌酶的表达。

本发明的解决方法是分离获得一种具有高活性的鸡蛋溶菌酶基因，经过PCR扩增、酶切等操作后，克隆到真核表达载体中，并转化整合到毕赤酵母基因组内进行表达，然后提取、纯化出高活性鸡蛋清溶菌酶。

这种生产基因工程鸡溶菌酶的方法，具体步骤如下：

(a)、将筛选获得的LYS蛋白质的核苷酸序列可操作性的连接于表达调控序列，形成LYS表达载体，所述的核苷酸编码一多肽，所述的多肽具有溶菌酶活性；

(b)、将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成表达LYS蛋白的重组细胞；

(c)、在适合表达LYS多肽的条件下，培养、表达步骤(b)中的重组细胞；

(d)、分离纯化出LYS蛋白。

本发明蛋白表达方法中的提取工艺为：工程菌种接种于BMGY培养基中，28℃，300rpm条件下摇床振荡培养36小时，离心收集菌体；重新悬浮、接种于含BMMY培养基的发酵罐中，流加100％甲醇诱导表达，控制溶氧度在30％以上，28℃条件下发酵100h，离心收集上清液，透析去离子，经过阳离子交换树脂层析柱，连续洗脱留取活性峰液，再透析去离子，经活性鉴定后分装冻干，即为成品。

鸡蛋溶菌酶作为饲料添加剂的应用，其使用方法为：按重量百分比计，溶菌酶添加量为10000～100000U/kg。

本发明有益的效果：由于采用基因工程重组技术，发酵生产基因重组鸡蛋清溶菌酶，能够较大批量的生产基因工程修饰的鸡蛋清溶菌酶，不受原材料来源的限制，显著提高溶菌酶的产量。其产品具有稳定、纯净、生物活性高的特点。

附图说明

附图1是本发明多肽核苷酸序列示意图；

附图2鸡蛋壳提取溶菌酶抑菌试验与Weatem-Blot分析结果

附图3 pIC6αA-mLYS单拷贝表达载体构建策略

附图4 pPIC6αA-mLYS多拷贝表达载体构建策略

附图5 pGAPZαA-mLYS单拷贝表达载体构建策略

附图6 pGAPZαA-mLYS多拷贝表达载体构建策略

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

一、获取鸡蛋溶菌酶基因

1鸡蛋清溶菌酶的提取工艺

将购买自全国各地的56种地方品种来源的鸡蛋作为原料提取鸡蛋清溶菌酶，工艺如下：

1.1配制蛋清液纯蛋清中加入适量去离子水，搅拌混匀，过滤，测浓度，备用。

1.2树脂吸附向制备的蛋清液中加入已经充分平衡后的阳离子吸附树脂，慢速搅拌，以树脂在液体中充分运动无死角为宜。室温下吸附2～3h，然后过滤将树脂蛋清分离，对树脂进行洗脱。