[发明专利]一种基因工程菌在制备泛酸中的应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种基因工程菌在制备泛酸中的应用。

(二)背景技术

泛酸(Pantothenic acid)，又名遍多酸、本多生酸、鸡抗皮炎因子，属于水溶性B族维生素，广泛分布于生物界中，于1933年从酵母中首次分离。泛酸在体内主要以辅酶A(CoA)形式参与糖、脂、蛋白质代谢。泛酸缺乏时，过氧化物酶体脂肪酸β-氧化受到抑制，并可能诱导脑部伤害。

泛酸是人及许多动物、微生物必须的营养物质。泛酸或D-泛酸钙被广泛地用作食品或饲料的营养添加剂。泛酸在临床上一直用于维生素B缺乏症、周围神经炎、手术后便梗塞、链霉素中毒及类风湿等；还可用于治疗斑秃、慢性炎症、抗氧和解决食欲不振、以及作为治疗肝紊乱的营养食品。另外，在食品上作为添加剂可增加食品风味。

D-泛酸钙的合成方法分为化学法和生物法，现在工业上普遍采用化学法。化学法首先要得到DL-泛解酸内脂。根据其合成起始原料的差异可分为三类：(1)异丁醛、甲醛法(即stiller法)；(2)异丁醛、羟乙腈法；(3)异丁醛、乙醛酸法。其中stiller法应用范为最广，现在改进的stiller法已不再使用剧毒NaCN。DL-泛解酸内脂可以采用手性试剂进行拆分(前拆分)，得到D-泛解酸内脂后直接与β-丙氨酸缩合得到DL-泛酸钙后采用物理方法进行拆分(后拆分)，即加入D-泛酸钙晶种诱导溶液中D-泛酸钙结晶。化学法生产成本高，生产场地安全性要求高，其原料、中间体及副产物有毒，对环境污染比较严重。

生物法分为直接发酵法和酶法转化与拆分，目前多处于研究阶段。

泛酸在生物体内主要通过泛解酸内酯和β-丙氨酸缩合生成。β-丙氨酸在生物体内有多条合成途径。国外对L-天冬氨酸脱羧获得β-丙氨酸已经有所研究。在L-天冬氨酸α-脱羧酶的作用下，L-天冬氨酸的α位羧基能立体特异性地脱去生成β-丙氨酸和CO₂，随着CO₂的释放，该反应基本上是不可逆的。1971年，Nakano等首先表明来自大肠杆菌B株的粗提取物中有此酶活性。1979年，Williamson等进一步研究了把大肠杆菌中的该酶纯化到表观均一后的酶活性。1980年，Cronan等也研究了β-丙氨酸在大肠杆菌中的合成，接着，人们又对该酶的晶体结构和形成机制进行了研究。但由于该酶的活性非常低，直接从自然界中筛选产酶高活力菌株比较困难，到目前为止还未见相关报道。1996年，美国NSC技术有限公司通过基因重组的方法，构建含该酶的菌株(NS3291)，用于拆分DL-天冬氨酸。

(三)发明内容

为解决现有技术中直接从自然界中筛选产酶高活力菌株比较困难、泛酸化学法生产成本高、对环境污染比较严重的不足，本发明提供了一种育种目标明确、效率高、合成β-丙氨酸的能力强的基因工程菌在制备泛酸中的应用。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

一种基因工程菌在制备泛酸中的应用，所述的基因工程菌通过如下方法制备得到：利用PCR扩增含有panD基因的供体菌的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因panD，并将其克隆到能高效表达外源基因的质粒上，得到panD基因高表达载体，再将所得的panD基因高表达载体转化入受体菌，即得到所述的基因工程菌。

所述供体菌优选为含有panD基因的埃希氏菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、分枝杆菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属、变形菌属、固氮菌属、根瘤菌属、克雷伯氏菌属、螺杆菌属、李斯特菌属、蛭弧菌属、产碱杆菌属、弗朗西斯菌属、志贺氏菌属、嗜冷杆菌属或嗜肺军团菌属的细菌。

所述受体菌优选为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、结核分枝杆菌、枯草杆菌、天蓝色链霉菌或富养罗尔斯通氏菌。。

所述能高效表达外源基因的质粒优选为下列之一：①pET系列，②pUC系列，③pGEM系列，④pBluescript系列，⑤pEKEx2系列，⑥pCMVT^NT系列，⑦pGA1系列，⑧pJC1系列。

具体的，所述基因工程菌制备方法如下：

(1)PCR扩增供体菌L-天冬氨酸α-脱羧酶基因panD，PCR产物经凝胶回收后克隆至能高效表达外源基因的质粒上，得到panD基因高表达载体；

(2)步骤(1)所得的高表达载体转化宿主菌感受态细胞，获得含有panD基因高表达质粒的宿主菌细胞；

(3)步骤(2)所得的含有panD基因高表达质粒的宿主菌细胞，涂布到含卡那霉素的适宜于培养细菌的培养基如LB平板上，20～37℃培养6～24h，即得所述基因工程菌。