[发明专利]人小RNA129荧光定量试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，为一种通过逆转录(RT)microRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可以精确定量检测标本中hsa-microRNA-129(hsa-miR-129，人小RNA 129)表达量的试剂盒。

背景技术

microRNA(miRNA)是一类新发现的非编码小RNA分子，长度为22nt左右，来自于基因组DNA的基因间隔区或者断裂的内含子中，自身不编码蛋白，目前在人中发现了587种miRNA(microrna.sanger.av.uk/targets/v4)，hsa-miR-129是其中的一个家族。miRNA的发现被美国《科学》杂志评为2002年年度十大科技突破成果，并被排在首位。

miRNA基因首先转录产生几百至几千nt的初级产物(pri-miRNA)，在核内被RNaseIII内切酶家族Drosha酶切割成70nt左右的发夹状前体(pre-miRNA)。Pre-miRNA在Ran-GTP和转运蛋白Exportin-5的协同作用下转运出核，然后经Dicer酶切割成约22nt的成熟miRNA。成熟的miRNA在RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)引导下与互补mRNA完全或不完全配对，降解靶mRNA或阻遏其转录后翻译。这类非编码的小RNA分子通过调节基因的表达在生物发育、脂肪代谢、细胞的分化、增殖和凋亡等过程中发挥着重要作用。近期一些研究表明miRNA与肿瘤的发生及分化密切相关，在胰腺癌、肺癌、白血病和肝癌等肿瘤中均有报道，提示miRNA与肿瘤的发生有一定的关系。最近研究发现let-7可与肺癌细胞中的癌基因HMGA2(a high-mobility groupprotein)多靶点mRNA的3’非翻译区(3’UTR)结合，但其在肺癌中的生长抑制作用被HMGA2无3’非翻译区(3’UTR)的开放阅读框过度表达，癌基因HMGA2再次复活，结果是一些肿瘤通过染色体转位消除癌基因3’UTR与Let-7靶点的结合。其他研究发现，Zhang等对227个癌标本，包括109个卵巢癌(93个原发肿瘤，16个癌细胞株)，73个乳腺癌(55个原发癌，18例细胞株)45个原发黑色素瘤原代细胞培养株，用高分辨aCHG检测已知miRAN位于的基因区不正常的DNA拷贝数，癌组织和细胞株分别用Cy3、Cy5作标记，对照癌组织与细胞株荧光比值，DNA小于0.8为DNA丢失，大于1.2为增殖，针对每个miRNA基因所观测到的DNA拷贝数大于15％的肿瘤中有显著的更迭，37.1％(105/283)卵巢癌的miRNA基因位于DNA数不正常的基因区，乳腺癌为72.8％(206/283)，黑色素瘤为85.9％(243/283)，并发现hsa-miR-129在乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤中呈高表达。我们将经病理证实的7例膀胱移行细胞癌肿瘤组织标本及癌远端正常对照组织，采用miRNA芯片检测472条miRNA，发现7例肿瘤组织与正常组织存在大量差异miRNA，其中表达上调61条，表达下调68条，其中在5例以上患者表达均有差异的14条，Hsa-miR-129是上调表达的miRNA之一。

人小RNA 129(hsa-miR-129)的序列为5-cuuuuugcggucugggcuugc-25，仅有21nt，无法利用传统的RT-PCR方法进行检测，目前检测hsa-miR-129表达方法主要依靠克隆、northern blotting和引物延伸法等方法，但上述方法不仅操作复杂，技术要求高，而且价格昂贵，费时费力，且不能进行定量。虽然芯片方法能够高通量检测microRNA(miRNA)表达谱，但其灵敏度及特异性限制了该方法对hsa-miR-129的定量检测；一些研究采用随机引物进行RT-PCR检测前体miRNA，但并不适用于成熟的hsa-miR-129检测。实时荧光定量PCR是定量检测基因表达的金标准。但由于hsa-miR-129长度仅为21nt，因此很难设计普通PCR检测hsa-miR-129。

发明内容