[发明专利]一种地衣芽孢杆菌纤溶酶及其生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种地衣芽孢杆菌纤溶酶及其生产方法。

背景技术

血栓栓塞性疾病是一类严重危害人类健康的心血管疾病，发病率呈上升趋势。目前治疗血栓栓塞性疾病的最为有效并且可靠的手段是采用纤维蛋白溶解酶或其激活剂进行的溶栓疗法。溶栓药物或通过激活纤维蛋白溶解酶原转化成纤维蛋白溶解酶，后者催化血栓的主要基质纤维蛋白水解，使血栓溶解，血管再通达到溶栓的目的；或者直接溶解血栓中的纤维蛋白，使血栓溶解。溶栓酶可来源于人体[如尿激酶(UK)、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)等]、动物(如腹蛇抗栓酶、月激酶等)、微生物等。

第一代溶栓剂链激酶(SK)和尿激酶(UK)缺乏纤维蛋白选择性，不仅能激活血栓表面的纤溶酶原，也能激活血浆中游离的纤溶酶原，使得纤维蛋白原降解，会产生全身性出血的副作用。而且SK具有免疫原性会产生过敏反应。第二代溶栓剂组织型纤溶酶原激活剂(tPA)和尿激酶原(proUK)等较第一代溶栓剂对纤维蛋白亲和性有所提高，但半衰期短、用药剂量大、价格昂贵，且口服仍会引起内出血的副作用。

自从1987年日本学者须见洋行从日本传统发酵食品纳豆中提取出一种具有纤溶性质的酶——纳豆激酶(NK)以后，通过微生物发酵方式生产纤溶酶引起了研究者们极大的兴趣。微生物的生长速度快，生长条件易于控制，因而可以通过人工控制发酵条件来获得大量的目的产物。现在世界各国的发酵工业都比较发达，发酵产物的提取工艺也比较完善。因此，对由微生物所分泌的纤溶酶类的研究将会为临床所大量使用这类溶栓药物提供广阔的前景。

微生物是溶栓药物的重要来源，现已成功筛选到许多产生纤溶活性物质的菌株，如芽孢杆菌(Bacillus sp.)CK11-4、曲霉菌(Asperillus sydowii)和旋孢霉菌(Cochliobolus lunatus)等均能产生纤溶酶。因此开展高产纤溶酶的新菌种筛选与发酵生产和酶的分离提取是解决溶纤酶理论研究和应用的前提。

目前主要利用微生物生产纤溶酶，但是现有的纤溶酶产生菌存在着产酶水平普遍偏低、酶学性质缺陷和安全性等问题。因此探索其它新型、安全的纤溶酶产生菌或改造已有的微生物纤溶酶显得很有必要，具有极大的研究和开发价值。

发明内容

本发明提供一种地衣芽孢杆菌纤溶酶及其生产方法。

本申请人在申请号为200510060829.1、申请时间为2005年9月20日的发明专利申请“一种芽孢杆菌菌株及其用途”中公开了一种保藏号为CGMCC1397的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的菌株ZJUEL31410。

研究发现该菌株既可以在葡萄糖、酵母膏合成培养基上生长，也可以在以麸皮和酵母膏、大豆浸出汁的粗培养基上生长产酶，此时主要代谢产物为纤溶酶，即地衣芽孢杆菌纤溶酶。

一种地衣芽孢杆菌纤溶酶，通过如下方法制得：将菌种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJUEL31410 CGMCC 1397进行发酵培养得到发酵液，从发酵液中分离纯化得到地衣芽孢杆菌纤溶酶。

所述的发酵培养前菌种采用LB培养基斜面保存，并在37℃预培养24小时。预培养后将菌种转移到发酵培养基中进行培养。

所述的发酵培养采用液体发酵培养基，以重量百分比计，含有如下组份：

葡萄糖或麸皮    1％～4％

酵母膏          1％～3％

豆汁            8％～12％

CaCL₂           0％～0.1％

KH₂PO₄          0.5％～1％

K₂HPO₄          0.1％～0.7％

MgSO₄           0％～0.6％

余量为水；

所述的豆汁制备方法：1重量份黄豆在9重量份水中浸泡24h，文火煮沸30min，过滤取汁。

所述的发酵培养接种量为1％，发酵温度37℃，摇床转速为120～140r/min，培养38～72小时。

从发酵液中分离纯化得到地衣芽孢杆菌纤溶酶过程分为酶的粗提纯和酶的精提纯。