[发明专利]一种黄绿蜜环菌纤溶酶及其生产方法

权利要求书

1.一种黄绿蜜环菌纤溶酶的生产方法，其特征在于：将黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens)ZJUQH CGMCC No.1884进行发酵培养得到发酵液，从发酵液中分离纯化得到黄绿蜜环菌纤溶酶；

所述的发酵培养采用液体发酵培养基，以重量百分比计，含有如下组份：

葡萄糖或麸皮       1～8％

酵母膏             1～4％

豆汁               10％

KH₂PO₄             0.1～1.5％

MgSO₄              0～0.6％

CaCl₂              0～0.2％

余量为水；

所述的豆汁制备方法：1重量份黄豆在9重量份水中浸泡24h，煮沸30min，过滤取汁。

2.如权利要求1所述的生产方法制备的黄绿蜜环菌纤溶酶。

3.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的发酵培养前菌种采用PDA培养基斜面保存，并在23℃预培养72小时，预培养后将菌种转移到摇瓶发酵培养基或生物发酵罐培养产纤溶酶。

4.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的发酵培养接种量为1×10⁸个孢子/ml，发酵温度28℃，摇床转速为120～140r/min，培养72～120小时。

5.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的液体发酵培养基采用1mol/L的盐酸调节初始pH为4.0。

6.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的液体发酵培养基中还含有0.5～2％的吐温-80。

7.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的从发酵液中分离纯化得到黄绿蜜环菌纤溶酶过程分为酶的粗提纯和酶的精提纯；

酶的粗提纯：将发酵液经过高速冷冻离心后去除菌体得到上清液，上清液经分段盐析，将第二次盐析获得的沉淀物用pH7.5的巴比妥缓冲液溶解得到粗酶液；

酶的精提纯：将粗提纯得到的粗酶液经过Sephadex G-100柱层析，采用pH7.5的0.02mol/L磷酸盐缓冲液作为洗脱液，收集酶活在400-500IU/ml，其蛋白质含量在0.1～1mg/ml洗脱液，得到的洗脱液浓缩后过DEAE-Sepharose离子柱，用0.02mol/L pH7.5和0.02mol/L pH8.0巴比妥缓冲液线性梯度洗脱，收集酶活在400～500IU/ml，其蛋白质含量在0.01～0.1mg/ml洗脱液，将得到的洗脱液浓缩10～20倍后冷冻干燥获得酶活性较高的黄绿蜜环菌纤溶酶固体粉样品。

8.如权利要求7所述的生产方法，其特征在于：所述的高速冷冻离心的转速为10000～12000r/min，离心温度为4℃。

9.如权利要求7所述的生产方法，其特征在于：所述的分段盐析分为两次，分别采用质量百分比浓度为45％和80％的硫酸铵溶液进行盐析。