[发明专利]一种三磷酸腺苷的晶胶吸附层析分离方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种三磷酸腺苷的晶胶吸附层析分离方法，尤其是一种利用超大孔连续床晶胶吸附层析技术从发酵液中分离三磷酸腺苷(ATP)的方法。

(二)背景技术

ATP是生物细胞内的高能物质，是机体能量利用和储存的中心，参与体内脂肪、蛋白质、糖类和核酸等的代谢，其二钠盐在临床上广泛用于心肌疾病、脑溢血、肌肉萎缩、肝炎等疾病的辅助治疗。

ATP可通过叶绿体光合磷酸化法转化、酵母或产氨短菌等微生物发酵、酶转化以及从动物组织提取等方式进行制备。微生物发酵法是目前工业上生产ATP的主要方法。其主要工艺过程包括培养发酵、菌体过滤、杂蛋白沉淀、活性炭吸附、阴离子交换层析、去热原、结晶精制、干燥等多个步骤，工艺过程复杂，成本高。特别是，ATP吸附层析分离过程常用阴离子交换树脂，而常规粒状阴离子交换树脂介质的孔隙尺寸在纳米或亚微米范围，ATP的吸附主要通过扩散传质，达到吸附平衡需要的时间长。因而，料液在工业吸附层析柱内停留的时间常常长达数天至十多天，增大了过程成本。另外，环境温度较高时(如高于25～30℃的夏季)，料液很容易变质，导致生产操作无法顺利进行，严重影响了生产效率和ATP产品的质量。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种用超大孔连续床晶胶吸附层析技术(Supermacroporous Cryogel Chromatography，简称晶胶层析)迅速高效地分离ATP的新方法。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

一种三磷酸腺苷的晶胶吸附层析分离方法，所述方法如下：(1)将含有三磷酸腺苷的混合液调pH为酸性，以0.1～30cm/min流速上超大孔连续床晶胶介质床柱，进行吸附；所述晶胶介质为阴离子交换晶胶介质，所述阴离子交换晶胶介质的孔径为5～400μm、孔隙率为50～98％、功能基团为胺基或其衍生基团；(2)以去离子水或pH值1～6的稀酸溶液为冲洗液冲洗床柱，除去晶胶介质内残留的混合液；(3)用洗脱液进行洗脱，收集含三磷酸腺苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸腺苷，所述的洗脱液为含有0.001～3M碱金属盐的稀酸溶液。

阴离子交换超大孔晶胶介质的制备可通过结晶致孔、聚合反应和孔内接枝方法实现。首先，将聚合物单体、交联剂、催化剂的水溶液装入层析柱(如常规层析玻璃柱)，在冷冻条件下进行结晶致孔，得到超大孔晶胶基质。然后，将带有阴离子交换功能基团的接枝单体溶液注入晶胶基质，在催化剂作用下进行孔内接枝聚合反应，得到阴离子交换超大孔连续床晶胶介质。晶胶基质的制备方法可参照文献中介绍的方法(Yao et al.，Chem.Eng.Sci.61，6701-6708，2006)；基质孔内接枝聚合反应也可参照文献(Savina et al.，J.Chromatogr.A 1092，199-205，2005)。具体过程见后面的实例。

所述阴离子交换晶胶介质优选为叔胺或季胺型阴离子交换晶胶介质。

所述胺基或其衍生基团优选为下列之一：①-N⁺(CH₃)₃、②-N(CH₃)₂、③-N(C₂H₅)₂。

所述步骤(2)中冲洗液流速0.1～20cm/min。

所述步骤(3)中的洗脱为梯度洗脱，洗脱液流速0.1～20cm/min，步骤如下：先用含碱金属盐0.001～0.06M、pH 1～6的稀酸溶液I进行洗脱，再用含碱金属盐0.1～3M、pH 1～6的稀酸溶液II进行洗脱，收集含三磷酸腺苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸腺苷。

所述稀酸溶液、稀酸溶液I、稀酸溶液II各自独立为下列之一：①盐酸溶液、②硫酸溶液、③乙酸溶液、④柠檬酸溶液。

所述碱金属盐优选为NaCl或KCl。

所述步骤(1)中含有三磷酸腺苷的混合液为啤酒酵母发酵液。

具体的，所述方法如下：

(1)将含有三磷酸腺苷的啤酒酵母发酵液调pH为2～3，以2～10cm/min流速上超大孔连续床晶胶介质床柱，进行吸附；所述晶胶介质为阴离子交换晶胶介质，所述阴离子交换晶胶介质的孔径为5～400μm、孔隙率为50～98％、功能基团为下列之一：

①-N⁺(CH₃)₃、②-N(CH₃)₂、③-N(C₂H₅)₂；