[发明专利]一种壳聚糖微球固定化脂肪酶制备工艺

权利要求书

1.一种壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺，其特征在于所述的工艺按如下步骤进行：

(1)用戊二醛为交联剂制备固定化脂肪酶A：将假丝酵母脂肪酶溶于磷酸盐缓冲液a中，以壳聚糖微球为固定化载体，采用戊二醛交联，制备得戊二醛交联固定化的脂肪酶A；

(2)用乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐活化固定化的脂肪酶A制备固定化脂肪酶B：在用pH值为6.5～7.5磷酸盐缓冲液b配制的0.70～0.80mg/mL假丝酵母脂肪酶溶液中，加入固定化的脂肪酶A，所述的固定化的脂肪酶A的终浓度为0.005～0.0055g/ml，搅拌均匀后，再加入乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐溶液，搅拌3～8小时，使其充分固定，用去离子水冲洗，过滤，滤饼干燥得壳聚糖微球固定化脂肪酶B。

2.如权利要求1所述的壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺，其特征在于所述步骤(1)为：用pH值为6.5～7.5磷酸盐缓冲液a配制的0.75mg/mL的假丝酵母脂肪酶溶液中，加入壳聚糖微球，所述的壳聚糖微球的终浓度为0.005～0.0055g/ml，搅拌均匀后，再加入戊二醛溶液，使戊二醛的终浓度为2.0％～2.5％(g/ml)，继续搅拌5～7时后，使其充分固定，用去离子水冲洗，过滤，滤饼干燥，即得所述壳聚糖微球固定化脂肪酶A。

3.如权利要求1或2所述的壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺，其特征在于所述步骤(1)中所述的壳聚糖微球有80％以上的微球的粒径在50～200nm。

4.如权利要求1或2所述的壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺，其特征在于所述步骤(1)中所述的壳聚糖微球按如下方法制备：称取壳聚糖溶于体积分数为2％的乙酸溶液，制得质量分数为2.5％的壳聚糖酸性溶胶，在搅拌下，将所述的壳聚糖酸性溶胶缓慢加入到液体石蜡和司盘-80的混合液中，所述的液体石蜡的加入量为80mL/g壳聚糖，所述的的司盘-80的加入量为5mL/g壳聚糖，搅拌使溶胶液滴均匀分散，然后加入体积分数为25％戊二醛溶液，所述的戊二醛溶液的加入量为10mL/g壳聚糖，搅拌均匀，调pH至9～10，于70℃水浴保温2～4小时，静置冷却后，弃去油层，再依次用石油醚、丙酮、无水乙醇浸洗，过滤后，虑饼0℃真空干燥，得到壳聚糖微球。

5.如权利要求1或2所述壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺，其特征在于所述的磷酸盐缓冲液a或磷酸盐缓冲液b各自独立为Na₂HPO₄-KH₂PO₄、Na₂HPO₄-NaH₂PO₄或K₂HPO₄-KH₂PO₄。

6.如权利要求2所述壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺，其特征在于所述步骤(1)中加入的戊二醛溶液的浓度为25％(g/ml)。

7.如权利要求2所述壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺，其特征在于所述步骤(2)中加入的乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为0.2％(g/ml)。

8.如权利要求2所述壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺，其特征在于所述的制备工艺按如下步骤进行：

a)用pH值为7的Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液配制的0.75mg/mL的假丝酵母脂肪酶溶液中，加入壳聚糖微球，所述的壳聚糖微球的终浓度为0.005～0.0055g/ml，搅拌均匀后，再加入25％(g/ml)的戊二醛溶液，使戊二醛的终浓度为2.2％(g/ml)，继续搅拌5～7时，使其充分固定，用去离子水冲洗，过滤，滤饼干燥，即得所述壳聚糖微球固定化脂肪酶A；

b)用乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐活化固定化的脂肪酶A制备固定化脂肪酶B：在用pH值为7的Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液配制的0.70～0.80mg/mL的假丝酵母脂肪酶溶液中，加入固定化的脂肪酶A，所述的固定化的脂肪酶A的终浓度为0.005～0.0055g/ml，搅拌均匀后，再加入乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐溶液，振荡6h，使其充分固定，用去离子水冲洗，过滤，滤饼干燥得壳聚糖微球固定化脂肪酶B。