[发明专利]抗传染性法氏囊病病毒VP4蛋白单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抗体工程技术，具体为抗传染性法氏囊病病毒VP4蛋白单克隆抗体。

背景技术

传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)是传染性法氏囊病(IBD)的病原，主要侵害3-6周龄雏鸡的法氏囊中枢免疫器官，破坏表面带有sIgM的B淋巴细胞，并引起脾脏、胸腺及外周血液淋巴细胞的凋亡，导致以淋巴细胞衰竭、坏死为主要特征的免疫缺陷性和免疫抑制性疾病。该病发病率高，病程短，除疾病自身可造成机体损伤外，还可导致多种疫苗免疫失败，严重危害养禽业的健康发展。IBDV属双RNA病毒科(Birnaviridae)禽双RNA病毒属(Avibirnavirus)，无囊膜，具有单层衣壳，呈20面体立体对称，病毒基因组由双链双节段RNA组成，大节段A全长3259个核苷酸，含有两个部分重叠的开放阅读框架(ORF)，大ORF全长共3036个核苷酸，按NH2-VP2-VP4-VP3-COOH的顺序编码分子量为110kDa的多聚前体蛋白(VP2/4/3)，并剪切加工成为VP2蛋白前体(pVP2)、VP3和VP4蛋白，pVP2进一步加工成为成熟的VP2蛋白和4条多肽(pep46、pep7a、pep7b和pep11)；小ORF全长共435-447个核苷酸，编码VP5非结构蛋白。小节段B全长2827个核苷酸，只有一个ORF编码VP1蛋白。

VP4由243个氨基酸组成，分子量约为28kDa，属于丝氨酸蛋白酶，具有水解蛋白活性，主要作用是对多聚前体蛋白VP2/4/3进行自我水解，使之水解成为pVP2、VP3和VP4三种病毒蛋白，其中pVP2-VP4和VP4-VP3确切剪切位点分别定位于L512A↓A513和M755A↓A756。此外，VP4还能激活VP1的合成，与病毒在感染细胞后形成的微管状结构有关，有可能也参与了病毒组装，但不诱导凋亡。由于IBDV病毒粒子不存在VP4蛋白，无法获得自然状态下的VP4病毒蛋白，严重制约VP4蛋白特性和功能的研究，利用VP4重组蛋白制备特异性单克隆抗体可为VP4研究提供必要的试剂和技术手段，对探讨VP4蛋白在IBDV病毒粒子形成及其致病方面的作用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体。

本发明的单克隆抗体是用纯化的IBDV VP4重组蛋白为抗原，通过杂交瘤细胞方法获得的，能特异识别IBDV感染细胞病毒蛋白的单克隆抗体。IBDV VP4重组蛋白是将IBDV VP4基因克隆于原核表达载体pET-28a，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，分离包涵体，用8M尿素溶解，经镍螯合亲和层析纯化获得的表达蛋白。

该单克隆抗体的具体制备方法如下：

1、根据IBDV VP4基因cDNA序列设计一对引物，通过PCR扩增得到全长VP4基因。将IBDV VP4基因克隆于原核表达载体pET-28a，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达IBDVVP4蛋白；裂解表达菌体，分离包涵体，用8M尿素溶液溶解表达蛋白，经镍螯合亲和层析纯化，获得IBDV VP4重组蛋白。

2、用IBDV VP4重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，以HAT培养基选择性培养后，以VP4重组蛋白和IBDV感染细胞进行双重ELISA筛选和有限稀释法克隆化，获得分泌抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；将杂交瘤细胞注入经降殖烷致敏的BALB/c小鼠诱生腹水，对获得抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体特性进行鉴定。

3、以ELISA测定抗IBDVVP4蛋白单克隆抗体的腹水效价，间接免疫荧光鉴定抗IBDVVP4蛋白单克隆抗体与IBDV病毒蛋白的反应性和特异性，用单克隆抗体亚型测定试剂盒鉴定抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的Ig亚类。

本发明的优点是：(1)本发明提供的IBDV VP4重组蛋白制备方法简单，纯度高；(2)本发明提供抗IBDV VP4蛋白的单克隆抗体特异性强，制备方法简单；(3)抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体可用于VP4蛋白的特性和功能研究。

附图说明

图1为IBDV VP4重组表达质粒pET28a-VP4的鉴定图，图中1是阴性对照，2是质粒pET28a-VP4的PCR产物，3是100bp DNA ladder。