[发明专利]植物DNA病毒卫星沉默载体及其构建和使用方法

权利要求书

1.一种植物DNA病毒卫星沉默载体，其特征在于，它是含有两个正向重复拷贝的烟草曲茎病毒DNA 1分子的侵染性克隆，并在两个DNA1分子中间的复制酶开放阅读框下游位置引入多克隆位点XbaI、SmaI和BamHI。

2.根据权利要求书1一种植物DNA病毒卫星沉默载体，其特征在于，所述的烟草曲茎病毒DNA 1分子，含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的植物DNA病毒卫星沉默载体的构建方法，其特征在于构建步骤如下：

1)提取感染烟草曲茎病毒的烟草植物基因组总DNA，以该总DNA为模板，以DNA1XSB：5’-TCTAGACCCGGGATCCGAGTATAAATACGTTAATTTTGC-3和DNA1K：5’-GGTACCGTATTTAGTCCAAATACTCGTCGC-3’为特异性引物进行PCR扩增，PCR产物插入pGEM T-Vector，筛选得到正向插入的阳性克隆pGEM-mDNA1XSBK；

2)以提取的总DNA为模板，用另一对特异性引物，DNA1S：

5’-GTCGACGAGTATAAATACGTTAATTTTGC-3和DNA1X

5’-TCTAGAGTATTTAGTCCAAATACTCGTCGC-3’进行PCR扩增，PCR产物插入pGEM T-Vector，筛选得到的正向插入的阳性克隆pGEM-mDNA1XS，pGEM-mDNA1XS经XbaI和SalI双酶切后插入pGEM-mDNA1XSBK，得到阳性克隆pGEM-2mDNA1；

3)重组克隆pGEM-2mDNA1经SalI和KpnI双酶切后插入到植物表达载体pBINPLUS的SalI和KpnI位点，由此构建成病毒卫星沉默载体pBINPLUS-2mDNA1。

4.如权利要求1所述的植物DNA病毒卫星沉默载体的使用方法，其特征在于包括如下步骤：

1)根据目的基因在GENBANK中的基因序列设计带有酶切位点的引物，用RT-PCR方法扩增植物目的基因的cDNA片段，并克隆到pGEM T-Vector进行测序确认，然后利用酶切、连接分子手段将其插入病毒卫星沉默载体pBINPLUS-2mDNA1的多克隆位点处，构建成含目的基因cDNA片段的重组病毒卫星沉默载体；

2)带有含目的基因cDNA片段的重组病毒卫星沉默载体和中国番茄黄化曲叶病毒侵染性克隆pBINPLUS-1.7A通过三亲交配的方法分别导入EHA105农杆菌，用含有目的基因cDNA片段的重组病毒卫星沉默载体和pBINPLUS-1.7A的农杆菌混合溶液注射接种4-6叶充分展开的苗龄期的植株，诱导沉默植物目的基因，观察植物表型的改变；

3)在目的基因cDNA片段两侧核酸区域设计引物，利用实时定量RT-PCR技术检测沉默植株中目的基因mRNA的含量，对沉默的目的基因进行表达量的分析，根据基因表达量表型的变化确定该基因的功能。