[发明专利]副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

(一)发明领域

本发明涉及微生物测量的组合物，具体地说是涉及一种副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒及检测方法，FQ-PCR即为实时荧光定量聚合酶链反应。

(二)背景技术

副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus，vp)是一种嗜盐性细菌，属弧菌科(vibrio)弧菌属，存在于近海的海水、海底沉积物和鱼类、虾类、贝壳类等海产品中，是我国大陆沿海地区食物中毒和急性腹泻的主要病原菌。神奈川现象(Kanagawa phenomenon，kp)阳性菌株为致病菌株，该菌株含两种致病因子基因(tdh与trh)，从tdh与trh基因序列中设计的PCR引物可使神奈川现象阴性菌株漏检。不能完整地反映食品中副溶血性弧菌污染的详细情况。

目前，我国食品副溶血性弧菌国家标准检测方法是细菌培养法(GB4789-2003)，国标要求检测食品中所有副溶血性弧菌，但国标方法需经增菌、分离培养、生化鉴定、血清凝集等，存在操作繁琐、所需时间长(约4天)等不足。

随着微生物基因组学的发展，近年来又出现了一种实时荧光定量PCR技术，该技术把荧光标记、探针、计算机与PCR四种技术融为一体，是目前国际上公认的最灵敏、特异、重复性最好的核酸定性定量检测方法(本领域内普遍技术人员都知道)。根据副溶血弧菌的不耐热溶血索基因Thermolabile hemolysin或简称TLH的序列设计引物，可以进行所有已知的副溶血性弧菌的常规PCR检测。但是直接使用常规的PCR检测试剂盒来检测副溶血性弧菌，尚存在下列难以解决的技术问题：1、常规的PCR检测试剂盒的反应管内不含有TaqMan探针，必须“开盖操作”将PCR产物转移，进行琼脂糖电泳或Southem转移杂交等实验对PCR产物进行鉴定，容易污染，造成假阳性，而且耗费时间(4-5小时)，国家卫生部已限制其在临床上使用；2、常规PCR检测试剂盒不含标准品，不能对副溶血性弧菌进行定量检测；3、常规PCR检测试剂盒不能对副溶血性弧菌进行实时监测；4、常规PCR检测试剂盒灵敏度低。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种可定量定性、操作简便、实时快速、特异度好、灵敏度高、重复性好的副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒及检测方法，解决目前在副溶血性弧菌检测中需经增菌、分离培养、生化鉴定、血清凝集等步骤，从而使操作繁琐、所需时间长等不足，并能实现快速检测所有副溶性弧菌的效果。

所述的副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒由以下试管和各部分组成：副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒包括：PCR反应液管、样本处理液管、阳性对照管、阴性对照管、标准品管、去离子水管。

(1)、2×PCR反应液：内含2×PCR缓冲液、Taq酶、Mg++、KCl，序列为5′-CAC GCA TTG CGCTCT GAG T-3′的上游引物、序列为5′-CGA GAC ATC CCA GAA CAC AAA-3′的下游引物、序列为5′-FAM-TCG GGC GTC TGG TGC TGA-TAMRA-3′的TaqMan探针、去离子水；

(2)、DNA提取剂：内含0.9％NaCl和0.1％二硫基乙醇；

(3)、阳性对照管：内含副溶血性弧菌TLH基因；

(4)、阴性对照管：不含副溶血性弧菌TLH基因；

(5)、标准品管：病毒拷贝数浓度，2×10⁷cfu/ml、2×10⁶cfu/ml、2×10⁵cfu/ml、2×10⁴cfu/ml、10μM上游引物、10μM下游引物、3μM TaqMan探针；

(6)、去离子水管：管内试剂为去离子水，即为无菌双蒸水。

副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒中，其2×PCR反应液浓度为两倍稀释，上游引物浓度为10μM，下游引物浓度为10μM，TaqMan探针浓度为3μM，双蒸水各试剂的体积比为：2×PCR反应液∶上游引物∶下游引物∶TaqMan探针＝100∶4∶4∶4∶68。

所述的检测方法，是副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒用于快速检测所有副溶性弧菌的方法，该检测方法由下列步骤组成：先采集和处理待测标本再进行加样。

(1)、每份PCR反应液的配制；

(2)、溶血性弧菌模板制备；

(3)、标准品与阴性对照，阳性对照模板制备的各步骤与溶血性弧菌模板制备相同；；

(4)、待测样品、标准品；

(5)、预变性；