[发明专利]副溶血弧菌外膜蛋白ompK亚单位疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种副溶血弧菌外膜蛋白ompK亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)最初引起人们的重视是因为该菌是一种重要的人类肠道病原，常由食入未经烹煮的海产品而导致感染，出现呕吐、腹泻等症状。近年来，国内养殖的多种海水经济动物受到该菌的危害，包括大黄鱼、牙鲆、对虾、蟹类和养殖贝类等，导致严重的损失。目前普遍认为该菌为海水环境中的常在菌，是养殖动物的条件性病原。早期的研究中已经观察到了该菌主要外膜蛋白的免疫原性，但因为人类可以通过避免吃入不洁的水产品有效地预防该菌的传染，因此，与霍乱弧菌不同，并未开展针对该菌的免疫预防研究。近几年，国内对水产动物的弧菌病原及弧菌病的免疫预防研究已成为一个热点，部分学者对该菌外膜蛋白的组成及免疫反应性开展了初步研究，测试了对该菌脂多糖及全菌疫苗的免疫保护性，但有关该菌保护性抗原方面的系统研究尚未开展，该菌外膜蛋白对鱼类的免疫原性也尚未明确。

在1995年的时候，Inoue等研究者在弧菌中发现一种分子量约28kDa的外膜蛋白，该蛋白自然突变缺失的副溶血弧菌菌株对噬菌体KVP-40变得不敏感，从而确认该蛋白为此噬菌体的受体蛋白，所以命名为ompK。该蛋白在弧菌中广泛存在，针对该蛋白的免疫血清可以识别来源于多种弧菌的分子量相近的蛋白条带，而与对噬菌体KVP-40是否敏感并无关系。Inoue等在1995年已克隆到副溶血弧菌ompK的基因，其ORF全长792bp，编码的蛋白分子量约为28kDa，序列分析表明该蛋白是弧菌种类中独有的一种外膜蛋白。在肠杆菌科种类中，与ompK最接近的蛋白为Tsx孔蛋白，为核苷酸转运蛋白，也可能作为肠杆菌素或部分噬菌体的受体蛋白。本实验室对哈维氏弧菌(V.harveyi)的ompK已开展了部分研究，该蛋白的基因序列与副溶血弧菌同源蛋白高度相似，为一种热修饰性的孔蛋白，可能在物质运输方面具有重要的生物功能；已验证了该蛋白在大黄鱼中具有良好的免疫原性。

弧菌病是危害养殖海水鱼类的重要感染性疾病，尤其在高温季节，由副溶血弧菌导致的弧菌病常造成严重的死亡。养殖生产上，目前由于对出口水产品中抗生素残留的严格检测及农业部渔业司对多数抗生素类药物的禁用规定，老百姓基本无药可用，发病了往往只好听之任之，损失惨重。以主动免疫的方法针对性地预防疾病的发生，为海水养殖业受弧菌病严重侵害的窘境提供了一条解决措施，已成为目前迫切需要解决的难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种副溶血弧菌外膜蛋白ompK亚单位疫苗及其制备方法。

副溶血弧菌重组ompK蛋白亚单位疫苗为转化了重组原核表达质粒pET30a-ompK的大肠杆菌表达的重组蛋白ompK经纯化后的PBS溶液，其浓度为0.25-0.5mg/ml。

所述的原核表达质粒pET30a-ompK为以pET30a作为原核表达载体，含有以下编码序列的ompK基因的重组载体，该重组载体的保存号为CGMCC No.2153；

GCAGATTACTCTGACGGCGATATCCACAAAAACGATTACA   40

AGTGGATGCAATTTAACCTAATGGGTGCATTCAACGAGAA   80

AGGTTATGCTGAATCTTCTCATGATTACCTAGAGATGGAA  120

TTCGGCGGTCGCTCTGGTATTTTCGATCTTTACGGTTACG  160

TTGACGTATTCAACCTAGCTTCTGACCCAGGCAGCGACAA  200

AGCTGGCGGCGAGAAAATCTTCATGAAATTCGCACCACGT  240

ATGTCTCTAGACGCGCTAACTGGTAAAGACCTATCTTTCG  280

GTCCTGTTCAAGAGCTATACGTTTCTACTCTAATGGAGTG  320

GGGCGGTAACTCTGACGTTAACTCTCAAAAAATCGGTCTA  360

GGTTCTGACGTGATGGTACCTTGGTTAGGCAAAATCGGCC  400

TAAACCTATACGGTACTTACGATGGCAACAAGAAAGATTG  440

GAACGGTTTCCAAGTTTCTACTAACTGGTTCAAACCATTC  480