[发明专利]一种紫杉醇类抗癌药敏感性相关基因检测试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种紫杉醇类抗癌药敏感性相关基因检测试剂盒，是通过利用SYBR GREEN I荧光定量PCR，检测肿瘤组织中紫杉醇类抗癌药敏感性相关基因，微管不稳定蛋白(Stathmin)基因mRNA表达水平的试剂盒。

技术背景

紫杉醇已成为卵巢癌术后常规一线化疗药物，紫杉醇联合铂类化合物已成为晚期卵巢癌的标准化疗方案。尽管在临床上紫杉醇显示了一定的疗效，但大多数患者最终还是死于复发和耐药，药物的毒副作用大于治疗作用，严重影响病人的生存质量。因此，治疗前药物敏感性预测，合理选择治疗方案将有利于提高疗效和生存质量，减少不必要的不良反应。

随着基因组学的发展，临床治疗模式开始由过去的诊断导向治疗逐渐向基因导向性治疗的新模式转换，为从分子水平预测药物敏感性提供了新的理论依据。紫杉醇作为抗微管类药物，可使微管和微管蛋白二聚体之间失去动态平衡，诱导和促进微管蛋白聚合防止解聚，稳定微管，导致细胞在有丝分裂时不能形成纺锤体和纺锤丝，抑制了细胞分裂和增殖，从而发挥抗肿瘤作用。有研究表明，微管蛋白结合和微管动力的改变均能影响机体对紫杉醇的敏感性，从而影响疗效。

Stathmin蛋白是微管辅助蛋白中最保守的可溶性蛋白。它具有解聚微管的作用，主要作用于微管蛋白、微管及纺锤体等对细胞分裂起关键作用的细胞器，通过调节微管系统的动力学平衡达到控制细胞周期的作用。它可以通过与微管蛋白二聚体结合和诱发突变促使微管不稳定，也可以通过改变其磷酸化状态来调节微管解聚的活性。Stathmin蛋白的磷酸化是细胞由G2期向M期转变，纺锤体形成的必要条件。Stathmin蛋白表达增加，微管的聚合减少，纺锤体无法形成；Stathmin蛋白表达表达减少时，微管聚合。

除参与微管解聚功能外，许多研究表明Stathmin与肿瘤密切相关。Stathmin蛋白在许多恶性肿瘤中均有高表达。虽然目前没有直接证据表明其与恶性转变过程直接相关，但有实验证明高表达Stathmin蛋白的组织有更高的增殖活性，而且参与了肿瘤的浸润和转移。除此之外，Stathmin的高表达影响了微管结合类抗癌药物的敏感性。如Stathmin可以干扰紫杉醇与微管的结合，影响其疗效。荧光激活细胞分类和分裂指数计数实验发现过表达stathmin的细胞大多进入了G2期后不能进入M期，Stathmin蛋白通过改变紫杉醇与微管的结合和减少进入有丝分裂的细胞数降低了紫杉醇的细胞毒作用。

紫杉醇耐药细胞株1A9/Ptx-10和1A9/Ptx-22中Stathmin的表达水平明显高于与母系1A9中的表达；人乳腺癌，高表达Stathmin蛋白的细胞对紫杉醇敏感性下降；抑制Stathmin蛋白表达能够增加癌细胞对紫杉醇的敏感性；Stathmin反义核酸与紫杉醇合用有协同抗肿瘤效应。本发明用SYBR Green I荧光染料适时定量方法检测了76例卵巢上皮癌组织中Stathmin基因的表达，这些患者均进行了术后铂类加紫杉醇的辅助化疗。研究结果发现Stathmin表达高的患者疾病进展生存时间和总生存时间均比Stathmin表达低的患者短，死亡危险比是Stathmin表达低的患者的4.45倍，Stathmin基因表达的差异与紫杉醇疗效和卵巢癌预后密切相关。

目前荧光实时定量PCR所使用的荧光化学方法主要有染料法(SYBR GreenI染料)和探针法。其中SYBR Green I荧光染料定量PCR法不需要设计合成序列特异性探针，而且熔点曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析和识别扩增产物和引物二聚体，是一种简便，性价比较高的实时监测方法。

发明内容

本发明的目的是为克服定量PCR探针法技术需要设计合成序列特异性探针，检测成本高的不足之处，采用SYBR Green I染料定量PCR技术，提供一种紫杉醇类抗癌药敏感性相关基因检测试剂盒。

本发明由盒体、衬垫，染料法(SYBR Green I染料)PCR反应液、Taq酶、标准品、阴性对照、阳性对照组成，衬垫上设有容器孔，分别放置染料法(SYBR Green I染料)PCR反应液、Taq酶、标准品、阴性对照、阳性对照。

其中染料法(SYBR Green I染料)PCR反应液的成份主要包含：PCR缓冲液、SYBR Green I染料、MgCl₂、dNTPs、检测用引物。

检测用引物有两对：检测基因，Stathmin；管家基因：3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。