[发明专利]一种铂类抗癌药敏感性相关基因检测试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种铂类抗癌药敏感性相关基因检测试剂盒，是通过利用SYBR GREEN I荧光定量PCR，检测肿瘤组织中铂类抗癌药敏感性相关基因，切除修复交叉互补基因(ERCC1)的mRNA表达水平的试剂盒。

技术背景

化疗是恶性肿瘤治疗的重要手段之一。但目前大多数实体肿瘤的化疗效果并不理想，达不到预期目的。由于肿瘤患者对化疗的反应各异，对化疗药物的敏感性亦存在差异，而临床医生往往仅凭经验对不同肿瘤患者使用同一种化疗药物或同一套化疗方案，显然带有一定的盲目性。临床化疗的成败对肿瘤患者的治疗和提高生存期有着举足轻重的影响。因此，临床上迫切需要有切实可行的检测方法，在化疗前筛选出针对性强、毒副反应较小且敏感的化疗药物，进行个体化治疗，以提高治疗效果，减少不必要的不良反应，防止耐药的发生。

20世纪50年代Back&Speer首先提出抗肿瘤的个体化治疗思想。单凭经验用药有效率仅14％左右，倘若能根据现有的药敏测试方法指导选药，其疗效可提高至28％～35％，并可减少药物的不良反应，防止多药耐药的产生。多年来，国内外相继创建了一系列体内、外预测肿瘤化疗药物敏感性的方法，体内法目前常用的有裸鼠皮下移植药敏测定法，移植瘤模型对抗癌药的反应与临床有较好的相关性，对临床疗效有重要的参考价值。但其费用昂贵，移植瘤生长慢，试验周期长，不适合临床常规使用。体外法主要有人体肿瘤细胞集落测定(HTCA)，放射性标记代谢物前体掺入法，快速荧光分析法，MTT比色法，细胞团法，三磷酸腺苷法等。这些肿瘤药敏试验体外法虽然快速、特异性强、灵敏度高、且较经济，但需要从原发肿瘤体外分离并培养，脱离了原发肿瘤的生长环境，培养成功率低。因此，目前药敏试验研究主要集中在试验室研究，真正进入临床前瞻性试验、指导临床用药的报道较少。

如今随着药物基因组学的发展，药物活性及毒性相关基因研究的深入，药物治疗模式开始由过去的诊断导向治疗向根据个体的遗传结构实行基因导向性治疗的新模式转换，为从分子水平研制和开发药物敏感试剂盒提供了新的理论依据。不同的个体，药物代谢酶基因及药物作用靶点基因表达是有差异的，这些基因的变化，如多态性、突变及过表达与肿瘤临床治疗的敏感性密切相关。因此，通过检测这些药物相关基因变化，来选择合理的化疗方案，将对肿瘤的个体化治疗和预见性治疗具有指导意义，可提高肿瘤临床治疗的效果。

作为广谱抗肿瘤药物，铂类抗癌药广泛应用于肺癌、卵巢癌、食管癌、头颈部鳞癌、肠癌及膀胱癌等上皮来源的肿瘤。它主要作用于DNA，形成泡状链内铂-DNA加合物，引起DNA复制障碍，抑制细胞分裂。铂-DNA损伤的清除是通过核苷酸剪切修复(NER)完成的，在这一通路中，限速酶切除修复交叉互补基因(ERCC1)扮演了重要的角色。许多研究表明ERCC1基因过表达可能改变DNA修复能力，从而直接影响以铂类为基础联合方案的疗效。2006年9月新英格兰杂志发表的文章表明ERCC1蛋白表达阴性的患者术后辅助铂类联合化疗能明显提高患者的生存(OR 0.65；95％CI：0.50-0.86；p＝0.002)，然而ERCC1阳性的患者对术后含铂类方案却不能获益(OR 1.14；95％CI：0.84-1.55；p＝0.40)。除此之外，ERCC1mRNA表达影响了肠癌，膀胱癌，非小细胞肺癌和卵巢癌的患者的治疗疗效和总体生存时间。

免疫组化是检测组织标本中ERCC1蛋白表达常用的方法，但大多数肿瘤患者是晚期，失去了手术机会，大快肿瘤组织难以获得。而实时荧光定量PCR技术以其特异性强、所需组织少(活检组织，脱落细胞等)、定量、敏感、方便等优点已得到全世界的公认，广泛用于肿瘤相关基因、病原体等诸多临床检测。用定量RT-PCR法检测药物敏感相关基因来预测药物疗效是必然趋势，而成熟、标准的试剂盒是定量PCR成功检测的关键。目前荧光实时定量PCR所使用的荧光化学方法主要有染料法(SYBR Green I染料)和探针法。其中SYBRGreen I染料法不需要设计合成序列特异性探针，而且熔点曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析和识别扩增产物和引物二聚体，是一种简便，性价比较高的实时监测方法。

发明内容

本发明的目的是为克服定量PCR探针法技术需要设计合成序列特异性探针，检测成本高的不足之处，采用SYBR Green I染料定量PCR技术，提供一种铂类抗癌药敏感性相关基因检测试剂盒。