[发明专利]β－葡萄糖苷酸酶在干酪乳杆菌表达系统中的诱导表达方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及的是一种生物材料的制备方法，具体地说

二、背景技术

近年来，人们一直致力于研究新型的口服疫苗以避免传统的注射疫苗所具有的缺点。大量的细菌、病毒及寄生的病原体都是通过粘膜表面进入机体的，因此作为一种免疫途径口服疫苗要优于传统的注射疫苗；注射疫苗虽能引起系统免疫应答，但不能有效的诱导机体产生分泌型抗体sIgA；口服疫苗不但使用比较方便且成本不高，对于很多病原体来讲口服免疫可能会产生群体免疫效应，即在群体内部仅有几个成员获得免疫时，这种免疫力会在群体内部成员之间传播，这些优点尤其适用于工业化程度不高的国家。因此，对口服疫苗抗原传递活载体的研究和选择就变得极为重要。

理想的黏膜免疫活载体疫苗可以促进抗原和免疫系统之间的有效接触、刺激体液和细胞免疫反应、在单剂量免疫以后产生长期的免疫保护作用，并且稳定、无毒性。目前研究得最多的是致弱病原菌载体，因其仍可能保持侵袭性和毒性使它们在应用于儿童和免疫缺陷者时受到限制。针对基因工程致弱微生物大范围应用的安全和环境问题，发展了以乳酸菌为代表的非致病性革兰氏阳性菌载体。几个世纪以来，乳酸杆菌被用于生物加工及食品和饲料保鲜等各个领域，他们被认为是一类安全的食品级微生物，而其它的活菌疫苗载体则未被归为安全类；而且，某些乳酸杆菌是肠道内正常的菌群，在肠道内可以定植，是人和动物的健康促进因子，这一点是其它的活载体(减毒大肠杆菌、沙门氏菌、病毒)所无法比拟的；另外，研究表明肠道内的乳酸杆菌及其产物对肠道感染和某些癌症有对抗性，而且极有可能通过降低血液中的胆固醇含量而起到抗胆固醇的效应。乳酸杆菌其它可能的作用包括：增加肠道内有益菌，减少有害菌；增加食物的营养价值，减少乳糖不耐症；产生肿瘤坏死因子、干扰素、IgA抗体等。大量的优点使乳酸杆菌成为口服疫苗抗原传递的活载体最具吸引力的候选者。但是选择乳酸杆菌作为表达系统最重要的是其安全、没有内毒素，表达的外源蛋白无需纯化可直接连同菌体一起服用。再者，由于乳酸杆菌可以在肠道中定植存活，基因工程乳酸杆菌经过口服后，其表达的用于治疗或免疫作用的蛋白在肠道内就可以不断地被生产并且持续的发挥作用。乳酸杆菌表达载体已成功地用于不同的外源蛋白的表达，但是几乎所有以乳酸杆菌作为宿主菌表达蛋白的效率均不高，因此提高乳酸杆菌表达外源蛋白的能力已经成为研究的焦点。

三、发明内容

本发明的目的在于提供一种确定β-葡萄糖苷酸酶(gusA)在干酪乳杆菌表达系统中的诱导表达条件，为实现可替代gusA的外源基因在干酪乳杆菌中的表达奠定基础，确定了干酪乳杆菌作为口服疫苗传递载体的可行性及用干酪乳杆菌表达葡萄糖苷酸酶的方法。

本发明的目的是这样实现的：以干酪乳杆菌Lactobacillus casei393为宿主菌，通过细胞表面表达载体pPG611.1以及细胞外分泌表达载体pPG612.1表达β-葡萄糖苷酸酶。

以D-木糖作为诱导物，挑取pPG611.1/L..casei 393和pPG612.1/L..casei 393，接种于含有2％木糖的MRS基本培养基中，同时在木糖中培养不含质粒菌L.casei 393和生长于含有2％葡萄糖中的pPG611.1/L..casei 393作为对照培养，37℃静止培养过夜进行诱导，终止培养后分别取适量菌液做电泳分析；诱导条件为：pH值6.0至7.0、补充D-木糖终浓度为1％、乳糖中浓度为0.5mM，30℃静置培养至菌体浓度为A₅₉₀OD＝0.50。

本发明确定目的蛋白均在细胞内产生，细胞表面表达的目的蛋白结合在细胞壁上，而分泌表达的目的蛋白并未在上清中出现，实际上仍然结合在菌体上。本发明使用D-木糖作为诱导物诱导目的蛋白的表达；同时根据干酪乳杆菌的生长特性，从多方面探索了gusA的最佳诱导表达条件，该系统的高效表达为抗原传递奠定了基础。

1.有效的诱导物

本实验用D-木糖作为pPG611.1/L.casei 393及pPG612.1/L.casei393的诱导物，同时以葡萄糖作为对照，SDS-PAGE结果显示D-木糖诱导能够表达目的蛋白，进一步用Western-blot分析，结果表明获得的gusA蛋白具有抗原性。

2.目的蛋白表达的位置