[发明专利]用于检测硫酸盐还原菌的引物和荧光探针

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测微生物的引物和探针。

背景技术

硫酸盐还原菌(sulfate reducing bacteria，SRB)是一类与硫酸盐还原反应相关的细菌的总称。由革兰氏阴性菌(如脱硫弧菌属Desulfovibrio，脱硫杆菌属Desulfobacterium)、革兰氏阳性菌(脱硫肠状菌属Desulfotomaculum)、嗜热细菌(热脱硫菌属Thermodesulfobacterium)和嗜热古细菌(古生球菌属Archaeoglobus)等多种微生物构成。

SRB菌通过一系列复杂的生物化学反应将硫酸盐还原成H₂S和大量的硫化物，硫化物和H₂S不仅腐蚀油田生产设备；而且其腐蚀产物(金属硫化物)不溶于水，导致污水发黑、悬浮固体含量增加，使处理后水中悬浮固体含量超标，严重的危害了油田的正常生产。因此，快速定量检测硫酸盐还原菌对于油田水质检测和地面系统杀菌剂浓度的合理调节具有重要的生产指导意义。但是，目前SRB菌的定量检测方法(如：绝迹稀释法等)存在检测时间长、非特异性高、检测结果偏低的缺陷。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前SRB菌的定量检测方法存在检测时间长、非特异性高、检测结果偏低的缺陷，而提供的用于检测硫酸盐还原菌的引物和荧光探针。

用于检测硫酸盐还原菌的上游引物基因序列为5’-CGCTGAAATGACCATGATGG-3’；下游引物基因序列为5’-CGCGCATTTCACGAAGC-3’。

用于检测硫酸盐还原菌的荧光探针由报告荧光基团、淬灭荧光基团和探针基因序列组成；探针基因序列为5’-CTGAAGCCTTACGAAGATCG-3’，探针基因序列5’端标记的报告荧光基团是FAM，探针基因序列3’端标记的淬灭荧光基团是TAMRA。

SO₄^2-/SO₃^2-的氧化还原电位太低，致使硫酸根(或亚硫酸根)不能直接接受电子，因此硫酸根(或亚硫酸根)离子的还原首先需要硫酸根(或亚硫酸根)离子活化。在硫酸腺苷转移酶的作用下硫酸盐还原菌以ATP为代价将硫酸根离子激活，经过复杂的生物化学反应生成H₂S。所以，腺苷酰硫酸还原酶(adenosine-5′-phosphosulfate reductase，APS)是硫酸盐还原菌还原硫酸盐生成H₂S的关键酶。腺苷酰硫酸还原酶是一种寡聚铁硫黄素蛋白，含有一分子黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和12个原子的铁和不稳定硫；APS基因在硫酸盐还原菌中具有保守性结构框架，APS蛋白结构中包含有典型的硫酸盐-亚硝酸盐还原酶的保守框架CP-X_n-C-X₂-C-X₂-C框架，能与[4Fe4S]结合，是SRB菌共有的一个稳定靶位点；所以，本发明根据腺苷酰硫酸还原酶基因序列的保守区域设计了具有特异性的引物和荧光探针。本发明引物和荧光探针特异性高，在引物和荧光探针的双重作用下假阳性大幅降低。使用本发明的引物和荧光探针进行荧光定量PCR检测硫酸盐还原菌，检测时间短、从样本的模板DNA提取到荧光定量PCR检测全过程仅需6h。

附图说明

图1是具体实施方式四中以pGEM-T-DSR为底物的PCR扩增曲线图，图1中曲线①模板浓度为5.65×10⁷copies/μL的PCR扩增曲线，②模板浓度为5.65×10⁶copies/μL的PCR扩增曲线，③模板浓度为5.65×10⁵copies/μL的PCR扩增曲线，④模板浓度为5.65×10⁴copies/μL的PCR扩增曲线，⑤模板浓度为5.65×10³copies/μL的PCR扩增曲线，⑥模板浓度为0 copies/μL的PCR扩增曲线；图2是具体实施方式四中硫酸盐还原菌荧光定量检测标准曲线图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式用于检测硫酸盐还原菌的上游引物基因序列(FP)为5’-CGCTGAAATGACCATGATGG-3’；下游引物基因序列(RP)为5’-CGCGCATTTCACGAAGC-3’。

本实施方式检测引物根据APS基因在硫酸盐还原菌中具有的保守性结构框架而特异性设计、合成。