[发明专利]siRNA脂质体的制备

说明书

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及在制备siRNA脂质体过程中首先siRNA与鱼精蛋白结合形成复合物，具体涉及siRNA与鱼精蛋白按一定的比例结合后再制备成脂质体。提供了一种能够稳定、高效包裹核酸的脂质体。

背景技术

RNA干扰(RNAi)是指双链RNA(dsRNA)导入细胞后诱导靶mRNA发生特异性的降解，导致基因沉默的现象。又称为转录后基因沉默(PTGS)，是生物长期进化过程中对病毒、转录因子和其他转移核酸等外源物质的防御系统。

RNAi具有一些重要特征：(1)RNAi属于转录后水平的基因沉默(PTGS)机制，(2)具有高度的序列特异性；(3)具有抑制基因表达的高效性；(4)RNAi效应可以在不同的细胞间长距离传递和维持。

RNA干扰技术2002年被Science杂志评为年度十大科技成就之首，Nature杂志亦将siRNA评为年度重大科技成果之一。Bosher认为RNAi现象的研究可能是未来10年生物学领域中最激动人心，也最有可能产生丰富成果的领域之一。RNA研究的突破性进展，是生物医学领域近20年来，可与人类基因组计划相提并论的最重大成果之一。

1998年Frie发现RNAi现象后，很快科研人员开始用双链RNA作为抑制目的基因表达的试剂。典型的RNAi技术相对于反义技术有着特别的优势，它基本上对任何mRNA系列的作用都有着非常高的成功率。目前，RNA干扰的研究大多集中在丙型肝炎、爱滋病、流行性感冒、肿瘤等疾病的研究。

目前，限制siRNA(小干扰核糖核酸)临床应用的问题是如何把siRNA运输到体内。由于siRNA在体内易于降解，裸露的siRNA在体内未到达靶细胞发挥作用以前已经降解。人们采用了化学修饰的siRNA和阳离子型脂质体(在脂质体中加入DC-胆固醇或十八烷胺等)以及多聚赖氨酸脂质体复合物的方法。由于阳离子型脂质体和多聚赖氨酸脂质体复合物细胞毒性大，很难应用到临床。本发明采用临床上应用多年的鱼精蛋白作为与siRNA的结合物，制备siRNA-鱼精蛋白复合物脂质体，提高了脂质体的稳定性和包封率，降低了细胞毒性。

本发明的公开内容

本发明的目的是为了提高siRNA在脂质体中的稳定性和包封率，为siRNA进入细胞和在体内的运输至靶细胞提供一个手段，进而为siRNA的实验研究和临床应用创造条件。

本发明siRNA脂质体的原辅料包含磷脂、胆固醇、siRNA、鱼精蛋白、保护剂。磷脂是指天然磷脂、合成磷脂、氢化磷脂。胆固醇是指药用级胆固醇。siRNA是指化学合成的siRNA、修饰的siRNA、通过Dicer酶降解生产的siRNA。鱼精蛋白是指可以临床应用的药用级鱼精蛋白。保护剂是指糖类(麦芽糖、蔗糖、葡萄糖等)、醇(甘露醇、山梨醇等)、蛋白类(白蛋白等)。另外，为了脂质体的稳定和防止磷脂氧化还可加入适量的吐温，维生素E，维生素C。

本发明首先将siRNA与鱼精蛋白制成混合溶液作为被包封物，使用本领域技术人员所熟知的脂质体制备方法(如薄膜分散法、逆相蒸发法、注入法、熔融法等)制备siRNA-鱼精蛋白复合物脂质体。

本发明通过下列步骤来描述siRNA-鱼精蛋白复合物脂质体的制备：

1、siRNA与鱼精蛋白结合成为被包封物，将siRNA溶液与鱼精蛋白按照一定比例混合，其中siRNA与鱼精蛋白的质量比为：1∶1.1至1∶10。

2、使用本领域技术人员所熟知的脂质体制备方法制成siRNA脂质体。

siRNA是强极性物质，带有大量负电荷，极易溶于水，制成普通的脂质体，通常包封率很低，大约在30％左右；阳离子脂质体虽然在包埋siRNA的效果非常好，但是由于阳离子脂质体的细胞毒性，限制了它的临床应用。本发明制备的siRNA-鱼精蛋白复合物脂质体提高了siRNA包埋的效率，包封率达到80％以上，并且增强了siRNA的稳定性，由于使用的都是中国国家食品药品监督管理局批准的药用辅料，大大降低了细胞毒性和体内副作用，为临床应用创造了条件。

应用实例

下列实施例用于进一步说明本发明，并不意味着对本发明有任何限制。

实施例1：

取siRNA500μg，鱼精蛋白1mg，溶于5ml水中形成混合溶液。

取磷脂0.15g，胆固醇0.015g，吐温-80 0.015g，VE 0.0025g溶于5ml无水乙醇中制成脂质溶液。