[发明专利]网织红细胞检测试剂及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞检测试剂及方法，特别是涉及一种血液中网织红细胞的检测试剂以及检测方法。

背景技术

网织红细胞(reticulocyte)是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间的尚未完全成熟的红细胞。网织红细胞计数是评价骨髓造血功能和红细胞生成活力的重要指标。

在正常生理情况下骨髓从原始细胞到网织红细胞需4天，然后网织红细胞在骨髓中成熟48小时进入外围血液，血液中的网织红细胞继续成熟48小时变成成熟的红细胞。外周血中网织红细胞数量，对于评价骨髓红系造血及网织红细胞从骨髓到外周血的转送速率有重要意义

计数网织红细胞是血液学诊断中评估红细胞生成能力的基础性实验，是贫血的诊断、分型和疗效监测的基础，能够确认骨髓的化疗和移植疗效，监测EPO(促红细胞生成素)的疗效等。

网织红细胞是从骨髓释放到外周血的成熟红细胞的前体细胞，同成熟红细胞相比，其细胞内仍残存少量的RNA(嗜碱性物质)。测定网织红细胞的基本原理就是用某种染料与细胞内RNA结合，再通过显微镜镜检或采用流式细胞术(FCM)等方法检测被染色的网织红细胞。根据网织红细胞内RNA的含量的多少，将网织红细胞分成不同的成熟度，越是幼稚的网织红细胞内的RNA含量越高，越接近成熟的网织红细胞内RNA含量越少。

网织红细胞的镜检方法是1949年建立的利用新亚甲蓝(NewMethylene Blue，NMB)活体染色方法。用新亚甲蓝这种染料进行的活体染色被认为是确定网织红细胞的参考方法。目前，国内大多数医院仍采用煌焦油蓝乙醇溶液、煌焦油蓝盐水溶液或新亚甲蓝溶液进行染色、涂片，油镜下直接目测计数1000个红细胞中网织红细胞数。这种传统镜检法可以直接观察细胞的形态，又不需要昂贵设备，是诊治贫血的基本实验方法。但是，这种方法，需要在显微镜下人工统计大量的细胞数目(例如500到1000)，计数精确性差，而且缓慢、繁琐，受人为因素的干扰较大。

仪器分析具有几个优势，如使用自动血液分析仪、流式细胞分析仪等，所计数细胞量大而减少了统计误差，测量速度快而可测定大量样本，重复性好而增加可信性。目前，一般采用碱性色素对网织红细胞内的RNA着色，进行识别和计数。一般有两种方法，非荧光标记法，荧光标记法。

非荧光方式一般采用两种试剂组合，一种为使红细胞变为等体积的球形化试剂，另一种是如恶嗪750(Oxazine750)类染料(美国专利5,284,711；5,633,1 67；5,350,695；5,438,003；5,360,739)，对网织红细胞进行选择性染色。仪器通过测定光吸收的增加来鉴别于成熟红细胞，光的吸收量与胞内存在的RNA量成比例关系，仪器中的激光散射用于检测细胞体积和血红蛋白浓度。由于这类仪器是检测RNA与网红试剂沉淀在胞内的光吸收量，而并非荧光，因而克服了流式细胞仪在某些情况下由于红细胞自身产生的荧光而导致的误差。

荧光标记方式是采用RNA特异染色的荧光性碱性色素标记网织红细胞内RNA，用流式技术测定细胞的前方散射光强度及荧光强度。一般根据荧光强度的差别来辨别红细胞与网织红细胞。红细胞只有背景荧光，可通过设定一定的“阈值”来界定网织红细胞。由于网织红细胞成熟程度的不同，细胞内的RNA含量不同，成熟度越高的网织红细胞，其RNA含量越低，这样可以根据网织红细胞内被荧光标记的RNA的多少分成高荧光率(HFR)、中荧光率(MRF)、低荧光率(LFR)三部分。越是幼稚的网织红细胞显示出越强的荧光，而成熟的红细胞极少或没有荧光。成熟度不同的网织红细胞内RNA含量不同，标记上的荧光染料量的差异，而显示出荧光强度的差异，通过对荧光强度的测定，可以计算出网织红细胞的成熟指数。荧光染料标记的优势是灵敏度高，试剂使用量少。

流式技术是使用激光照射鞘流液中的血流细胞。由于红细胞是盘状结构，这样从不同侧面照射和收集发射光时，红细胞内的荧光染料所产生的荧光强度产生随机差异，为消除这种差异，一般采用球形化试剂将红细胞系、血小板等溶涨成等体积的球形，以尽量消除由于红细胞形状带来的检测误差。

通常，采用前向散射光强度-荧光强度分析经网织红细胞试剂处理的血液样本。前向散射光强度反应了细胞的大小情况，根据细胞大小可以分辨红细胞、白细胞、血小板；荧光强度则反应细胞内结合了荧光染料量的关系，可以根据荧光强度分辨网织红细胞和成熟红细胞。由于白细胞内含有大量的核酸物质，其着色的荧光染料量大大高于网织红细胞，通过荧光强度也可以有效的分辨网织红细胞与白细胞。