[发明专利]一种用于检测Ⅱ型猪圆环病毒核苷酸片段的引物和探针序列

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测II型猪圆环病毒核苷酸片段的引物和探针序列。

背景技术

猪圆环病毒(porcine circovirus，以下简称PCV)为无囊膜的单股环状负链DNA病毒，病毒粒子直径约17-20nm，是迄今已知最小的动物病毒之一。PCV属圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属成员，根据其抗原性及基因组成不同，分为2种基因型或称血清型，即I型PCV(简称PCV1)及II型PCV(简称PCV2)。PCV1是1974年首次从猪传代细胞系PK-15中作为一种污染物分离出来的病毒，动物实验表明该病毒无致病性，广泛存在于正常猪体内各组织器官。而PCV2与近年来发生的断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemicwasting syndrome，PMWS)密切相关。该疾病的发生和蔓延已给世界养猪业造成了巨大的经济损失。该病以渐进性消瘦、呼吸困难、淋巴结肿大、发育障碍及皮肤苍白等为主要特征。然而这些症状并不是PCV2感染后所特有的，其它许多病原感染也可引起类似的症状，如猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染，因此必须采用合适的检测方法来确定这些症状是否与PCV2感染有关。

随着对PCV2研究的深入，越来越多的资料表明，PCV2与猪群中发生的许多疾病密切相关，包括PMWS、猪皮炎肾病综合征、繁殖障碍、A2型先天性震颤、猪呼吸道病复合征以及猪增生性和坏死性肺炎等。

目前，对PCV2常用的检测方法有病毒分离，间接免疫荧光抗体法(IFA)、E11SA、原位核酸杂交(ISH)、免疫组织化学法(IHC)和PCR等。病毒分离是实验室确诊PCV-2感染最灵敏的方法，但由于PCV2在PKI5细胞上不产生病变，病毒分离耗时长且难度大。原位杂交虽然有很高的灵敏度，但操作烦琐，成本较高，周期长，并且对病料的要求较高。E11SA灵敏度高，但结果判断易受主观因素的影响，目前广泛应用的常规PCR检测方法简单快速，灵敏，但容易出现交叉污染，容易产生假阳性，而且由于PCV2的广泛存在，而临床发病与隐性感染的猪群中病毒量又存在明显的不同，常规PCR很难起到实时定量检测的作用。因此，建立一种更加快速、准确、操作简便检测方法势在必行。

实时定量PCR是近年来发展很快的一种检测方法，它是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术。除了具有普通PCR的优点外，它还具有以下优点：(1)特异性更强，灵敏度更高。由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了人工判断的主观性，又可进一步提高灵敏度。(2)全封闭反应，在线式实时监测荧光，无须PCR其PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，实现了扩增产物的实时动态检测和结果自动分析，避免了对扩增产物的后处理，有效地避免了实验室交叉污染，同时可在较短的时间内得到结果。(3)数据分析选在核酸扩增的对数期，摈弃普通PCR方法的受多因素干扰的终点分析法，使得定量更准确可靠。(4)可实现单管双检或多检，还可设计针对性内标，监控抽提效率及排除抑制剂干扰。(5)不接触有毒试剂，操作安全。(6)有利于规模化、自动化及联网管理。(7)适用范围更广，理论上可检测任何病毒的核酸。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测II型猪圆环病毒核苷酸片段的引物和探针序列。

基于上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于检测II型猪圆环病毒核苷酸片段的引物和探针序列包括：由上游引物PCV II pf517序列为AAATCTCATCATGTCCACCGC和下游引物PCV II pr615序列为GCTACCGTTGGAGAAGGAAAA组成的引物对。探针PCV II pb585序列为TTCAACACCCGCCTCTCCCGCA。