[发明专利]一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒核苷酸片段的引物和探针序列

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒核苷酸片段的引物和探针序列。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)属于动脉炎病毒属，是一种不分节段的单股正链RNA病毒，其导致的猪繁殖与呼吸综合征又称蓝耳病或神秘病，以引起猪呼吸道感染、仔猪死亡、母猪繁殖障碍等临床表现为特征。目前，该病广泛流行于欧美及亚洲国家，已给世界养猪业造成严重的经济损失。国际兽疫局将该病列为C类传染病。由于缺乏有效的疫苗，因而及时诊断疾病、及时处理疫情就变得十分重要，这就需要有一种既准确又快速的实验室检测方法来确定病原，但PRRSV与其它许多引起猪繁殖障碍的疾病(如细小病毒病、伪狂犬病、猪瘟、日本乙型脑炎、布病、钩端螺旋体病等)存在着许多类似的临床症状，因此极大地增加了本病诊断的难度。

猪繁殖与呼吸综合征病毒的实验室诊断，国内外都已建立了各种方法，主要有病毒分离鉴定，免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)，间接免疫荧光试验(IFA)，间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)和血清中和试验(SN)等，但这些方法都不同程度地存在着敏感性低、特异性差、操作繁琐、耗时等不足，因为这些方法都是建立在病毒分离培养的基础上，不适宜作为猪繁殖与呼吸综合征的早期诊断。

随着分子生物学技术的发展，普通PCR方法已经广泛应用于临床诊断，但该技术需要对PCR产物进行后处理，极易导致PCR产物污染，同时有一定的非特异性扩增。而荧光PCR技术则是在普通PCR技术的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术。除了具有普通PCR的优点外，它还具有以下优点：

(1)特异性更强，灵敏度更高。由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，

提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了人工判断的主观性，又可

进一步提高灵敏度。(2)全封闭反应，在线式实时监测荧光，无须PCR产物的后处理，避免污染，保证了结果的可靠性。(3)数据分析选在核酸扩增的对数期，摈弃普通PCR方法的受多因素干扰的终点分析法，使得定量更准确可靠。(4)可实现单管双检或多检，还可设计针对性内标，监控抽提效率及排除抑制剂干扰。(5)不接触有毒试剂，操作安全。(6)有利于规模化、自动化及联网管理。(7)适用范围更广，理论上可检测任何病毒的核酸。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒核苷酸片段的引物和探针序列。

基于上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒核苷酸片段的引物和探针序列包括：

由上游引物PRRSVpf序列为CCTGTGTCCGACCCAGTCG和下游引物PRRSVpr序列为TGGCAAGACCGAGACCGAC组成的引物对。探针PRRSVpb序列为TTTGAGCTTCTCAAACCTTGGGACCCTG。

本发明的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物和一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTP)等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在PCR扩增过程中，Taq酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，荧光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测到，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。

附图说明

附图：利用引物对PRRSVpf/PRRSVpr和探针PRRSVpb检测猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性样品的荧光PCR扩增图。

具体实施方式

1.引物和探针设计：通过分别对所有已知的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段，设计多对引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。最优引物、探针序列组合如下：

上游引物PRRSVpf：CCTGTGTCCGACCCAGTCG

下游引物PRRSVpr：TGGCAAGACCGAGACCGAC

探针PRRSVpb：TTTGAGCTTCTCAAACCTTGGGACCCTG