[发明专利]三重荧光定量RT－PCR检测A、B和H5亚型流感病毒的引物、探针、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种能够同时检测A型、B型和H5亚型流感病毒的三重荧光定量RT-PCR技术及其应用。 

背景技术

禽流感病毒(AIV)是由A型流感病毒引起的家禽和野禽的一种烈性传染病，给养禽业造成巨大损失，我国农业部和国际兽医局都将其定为A类传染病。禽流感其病理变化因感染病毒毒株毒力的强弱、病程长短和禽种的不同而不同。其临床症状因感染禽的种类、年龄、性别、并发感染情况及所感染毒株的毒力和其他环境等不同而表现出的症状很不一致。自1878年禽流感在意大利爆发和流行到如今已有100多年的历史。禽流感已成为具有重要公共卫生意义的传染病，该病不仅具有发生突然、传播迅速、发病率高、致死率高等特点，而且禽流感病毒是几乎所有A型流感病毒的基因库，其自然宿主的广泛性及遗传变异给禽流感的及时定性诊断和预防带来很大困难。由于候鸟的迁徙和国际间禽类贸易的日益频繁，使得该病呈全球性分布，给养禽业造成巨大的经济损失。以往认为禽流感病毒对人群无致病力，但1997年“香港H5禽流感、2000年H9、2003年荷兰H7至2004年亚洲的H5均发生感染人，甚至导致人员死亡，死亡率约30％左右。其危害性比2003年的SARS还大、还难于预料。给整个国民经济和社会的发展造成了严重的影响。长期以来禽流感的诊断一直依赖于病原的分离和鉴定。近年来相继建立的禽流感琼脂扩散(AGP)、血凝抑制试验(HI)、神经氨酸酶抑制试验(NI)、间接酶联免疫吸附试验(ELAISA)等血清学诊断技术及分子诊断技术(RT-PCR)，已经远远满足不了我国禽流感及呼吸道疾病的流行病学监测及现场诊断与防制的迫切需要。 

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，是集PCR扩增技术、探针杂交技术和荧光共振能量转移光谱技术于一体的新兴技术，该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，目前欧美、日本一些国家已广泛应用。荧光定量PCR技术的原理是指：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该方法 是目前国际上用在病毒检测上最先进的检测方法之一，具有普通的PCR扩增技术无法比拟的优点： 

1、特异性高。因为只有当探针与待测模板匹配时Taq酶才会启动其5’-3’端的外切酶活性，将探针上的荧光基团切割下来而产生荧光强度的增长，因此荧光定量PCR技术克服了普通PCR由于非特异性扩增而导致的假阳性问题。 

2、敏感度高。荧光PCR技术可检出极低拷贝数的核酸，使真正意义上的早期诊断成为现实。 

3、高通量、高效率。1～2小时可全自动同步完成近百个样品的扩增及检测，且结果重现性好。 

4、无须凝胶电泳，采用全封闭反应管及光电传导系统，无管道内污染。 

5、可对DNA和RNA的PCR产物进行定量分析。 

近几年欧美、日本一些国家也进行RT-PCR和多重荧光定量PCR的研究。国内未见多重荧光定量PCR检测流感病毒文献报道。目前国内常用的快速检测方法为传统PCR或半巢式-MPCR。上述方法存在一定的缺陷，如传统PCR或半巢式-MPCR技术易出现假阳性、交叉污染、操作步骤多和费时。而多重荧光定量PCR具有的操作简单、可定量、污染少、检测速度快，同时检测出多个不同型及亚型流感病毒(A型、B型、H5亚型和H9亚型)。检出病毒的最小量为10^-5TCID50等优点越来越受学者的认同和研究。“多重荧光定量PCR快速检测流感人(禽)病毒和准确分型”，这一研究不仅在国内属于首次，而且在国际上也属于先进水平。在我国流感快速诊断研究方面仍停留在传统PCR或半巢式-MPCR技术中，这与我国作为流感多发地来说是极不相称，因此，研究开发多重荧光定量PCR检测流感病毒技术，为使我国的流感病毒快速诊断技术尽快的与国际接轨，适应当今快速前进社会的发展，确保人们的生命安全和国家的利益具有重要意义。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种三重荧光定量RT-PCR检测A型、B型和H5亚型流感病毒的引物、探针、检测试剂盒及方法，以使能够同时检测A型、B型和H5亚型流感病毒，而且操作简单、可定量、污染少、检测速度快。 

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案： 

本发明三重荧光定量RT-PCR检测A型、B型和H5亚型流感病毒的引物及探针，其DAN序列如下：

A型      上游引物：5’CAGAGACTTGAAGATGTTTTTGC，