[发明专利]鹅毛玉凤花的组织培养繁殖方法

说明书

一、技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及鹅毛玉凤花的组织培养繁殖方法和所使用培养基。

二、背景技术

鹅毛玉凤花(Habenaria dentata)系兰科玉凤花属植物，属地生草本，其块茎具有温肾壮阳、散寒祛风、燥湿杀虫等药用功效。

鹅毛玉凤花生长的生态环境较为特殊，且植株生长缓慢；主要以地下块茎进行繁殖，一株苗一年只发生一个新的块茎，一个块茎仅萌发生长形成一植株，繁殖系数极低；植株开花结实率低，且多数发育不良，在自然条件下极难萌发形成新的植株。长期以来民间均依靠采挖野生资源作为药用，造成资源的枯竭。植物组织培养技术可以为人工栽培鹅毛玉凤花提供所需要的种苗，从而解决药源短缺和物种的濒危等问题。虽然目前许多兰科名贵花卉和药用植物的组培技术已较为成熟，但目前在国内外尚未见鹅毛玉凤花组培技术的报道。

本发明提供了一种鹅毛玉凤花的组织培养方法，解决其繁殖和物种保存问题，填补了国内外这方面的空白，对促进鹅毛玉凤花种质资源的保护及可持续利用具有重要的现实意义。

三、发明内容

本发明提供了一种鹅毛玉凤花的组织培养繁殖方法，以解决鹅毛玉凤花繁殖困难和种苗缺乏的问题。在无菌条件下，将采集的成熟蒴果消毒后切开果皮，将种子均匀地撒播于培养基表面，种子萌发形成原球茎，然后通过原球茎的增殖、分化，形成丛生苗，从而获得生产上所需的种苗。

本发明利用鹅毛玉凤花种子进行无菌播种，成功实现了种子萌发、原球茎的获得、原球茎的增殖及分化成苗、苗的增殖和组培苗的炼苗移栽等。

(一)本发明中的应用材料

鹅毛玉凤花[Habenaria dentata(Sw.)Schltr]种子，采自贵州省荔波县。

(二)本发明的技术方案

1.鹅毛玉凤花原球茎的诱导培养

将采集的野生鹅毛玉凤花蒴果进行消毒处理，后用无菌水冲洗，然后用无菌滤纸吸干水分。将其内部的种子均匀地撒播于固体培养基1/2MS+NAA(萘乙酸)0.5mg/L+3％蔗糖+0.2％活性炭，培养基pH5.8-6.0。种子培养10d后，发育良好的种子开始膨大，形成白色的原球茎，后逐渐长大，表面出现白色的细绒毛。

2.原球茎的增殖分化及其苗的增殖生根

将白色原球茎转接到增殖培养基1/2MS+NAA 0.2mg/L+ZT(玉米素)5.0mg/L+3％蔗糖+0.2％活性炭+0.75％琼脂粉上，pH5.8-6.0。培养约20d，白色小原球茎分化出叶原基，后长出第一片真叶，形成小苗；培养30d左右，在小苗基部增殖新生成丛生形原球茎，后产生分化，最后分化出丛生苗。将丛生的小苗分成单株转接在苗增殖培养基上，单株苗继续增殖成丛生苗，同时发生根的同步生长，每株苗长有2-3条新根。

3.组培苗的炼苗移栽

将生长有根和叶的小苗先在室温条件下，后用清水冲洗干净苗基部的培养基，栽种到准备好的基质上，浇淋透水，精心管理，40 d后即可移栽。

四、具体实施方式

1.种子的采集

将在野外采集鹅毛玉凤花成熟种子的蒴果，带回实验室后，用75％的酒精棉球表面消毒处理后置4℃的冰箱保存。

2.种子的无菌播种及原球茎的诱导

(1)外植体的消毒处理

将采集保存的野生鹅毛玉凤花未开裂蒴果，先用75％的酒精消毒处理20-30s，再用0.1％的升汞消毒灭菌15min左右，然后用无菌水冲洗5-6次，用灭菌过的滤纸吸干表面水分待用。

(2)种子的无菌播种和培养

用无菌的解剖刀将消毒处理好的蒴果纵向切开，将其内部的细小种子均匀地撒播于在1/2MS+NAA 0.5mg/L+3％蔗糖+0.2％活性炭的固体培养基上，pH 5.8-6.0。置于光照强度为1500-2000Lx，光照时间12h/d，温度为(25±2)℃的条件下培养。

(3)原球茎的获得

种子培养10d后，发育良好的种子开始膨大，形成白色的原球茎，后逐渐长大，表面出现白色的细绒毛。种子的萌发是不同步的，种子萌发形成的原球茎需要分步转接进行增殖。

3.原球茎的增殖、分化