[发明专利]农杆菌介导的花椒转基因方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的花椒转基因方法，包括下列步骤：

(1)将带腋芽幼嫩茎段及茎尖接种于诱导培养基中，以萌发20天腋芽的叶柄及茎段作为浸染外植体；

(2)将农杆菌单菌落，用牙签挑取，加入到YEP液体培养基中培养震荡培养，直到OD值达到0.4-0.7，离心收集菌体，用WPM重悬培养基重悬制得农杆菌菌液；

(3)将叶柄及茎段切成0.5cm左右的外植体，接种到诱导培养基于黑暗中预培养，培养时间48-72h，投入步骤b农杆菌菌液中，使外植体与农杆菌充分接触，取出外植体，转入共培养基上培养48-72h，然后转入筛选培养基中诱导芽再生，最后将材料接种到生根培养基中诱导生根。

2.如权利要求1所述的农杆菌介导的花椒转基因方法，包括下列步骤：

(1)材料消毒方法：田间取外植体在流水中冲洗2h，用少量洗衣粉刷洗材料表面，再用流水将洗衣粉充分冼净，75％酒精表面消毒45s后无菌水冲洗1次再用0.1％升汞消毒7min后无菌水冲洗5次，切取0.5-1cm带腋芽茎段接种于诱导培养基；

(2)农杆菌的准备：用接种针蘸取-80℃冻存的含有pBin19重组质粒的农杆菌，在YEP固体培养基上划平板，28℃恒温培养24-48h至长出合适大小的菌斑；用牙签挑取农杆菌单菌落加入到5mlYEP液体培养基中，28℃200rpm震荡培养24h，于5ml菌液中取500ul加入50ml YEP液体培养基中，28℃200rpm震荡培养，直到OD值达到0.4～0.7；将菌液转移到50ml离心管中，6000rpm，4℃离心10min，收集菌体；用WPM重悬培养基重悬离心收集的农杆菌，调节菌液OD值在0.3～0.4之间；

(3)植物材料的农杆菌侵染：取诱导培养20天腋芽叶柄及茎段，切成0.5cm左右的切段，接种到诱导培养基中黑暗中培养48-72h后，投入预先准备好的农杆菌菌液中，不断摇动，使外植体与农杆菌充分接触，6～8min后，取出外植体，置于干燥无菌滤纸上吸去多余的菌液，转入共培养基上，培养48-72h，立刻转入筛选培养基中诱导愈伤组织的产生；

(4)分化及壮苗：材料转入筛选培养基后2周可见愈伤组织产生，3个月后愈伤组织再分化出芽，再生的芽4-5周后，小苗长至3-4公分高；

(5)完整植株的获得：将小苗转至生根培养基中诱导生根，2周后材料下端长出白色小根，继续培养即获得花椒转基因植株试管苗；

其中：植物组织培养各个阶段，除共培养及预培养阶段不需要光照外，培养条件为光照强度为2000lx，每日光照16小时，培养温度(26±2)℃；

生根培养基为1/2WPM培养基，其余培养基均为WPM常规培养基。

3.如权利要求2所述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中：共培养基中含有0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖，重悬培养基中含有20g/L蔗糖。

4.如权利要求3所述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中：诱导培养基中含有0.5mg/L-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸及30g/L蔗糖，筛选培养基1中含有0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、150mg/L头孢霉素及30g/L蔗糖。

5.如权利要求4所述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中：1/2WPM生根培养基中含有150mg/L头孢霉素及20g/L蔗糖。