[发明专利]幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及重组单克隆抗体，特别涉及一种幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体及其应用。

背景技术

自1983年Warren和Marshall从胃粘膜组织中发现幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)以来，大量研究已经表明该菌是引起慢性胃炎和胃溃疡的最常见原因，在胃溃疡的复发及胃癌的发生中起到重要作用。Hp的感染非常普遍，发展中国家高于发达国家，发展中国家流行特征为儿童期易感型，婴幼儿甚至出生几个月的新生儿都可能受到感染，并以每年3-10％的速度上升，因各种体检未将Hp感染的检查作为常规指标，多为引起临床症状就诊时才发现，一旦感染，将终身受累，自愈率几乎为零。感染者中慢性胃炎的发病率为45-85％、消化性溃疡为10-20％、胃癌和淋巴瘤为40.61/10万。在我国普通人群中的感染率为50-80％，并以每年1-2％的速度增加。预防Hp感染，对保护人群健康具有重要的现实意义。

目前，已发现Hp的毒力因子有多种，如鞭毛、黏附因子、尿素酶、蛋白水解酶、毒素相关蛋白、细胞空泡毒素(vacuolating cytotoxin A，VacA)等，其中VacA是一种重要的致病物质。1988年，Leunk首先发现Hp具有使真核细胞空泡变性的毒素，并命名为细胞空泡毒素(VacA)。1992年，Cover和B1aster提纯了该毒素。大多数学者认为VacA属于A-B型结构的细菌毒素，即37000Da片段是毒性亚单位，58000Da片段是结合亚单位。其致病机理尚未完全明了，多认为VacA可通过受体介导的内吞作用进入细胞内，引起内吞作用障碍，最终导致细胞内空泡样变性；同时能够在胞浆膜上形成通道与增强极化上皮单层细胞的渗透性，导致细胞死亡。流行资料表明虽然50％-60％人群感染Hp，但临床上仅有15％的感染者出现症状。Hp的其他毒力因子几乎存在所有的菌株，因此不能解释Hp感染后的不同临床表现。而编码VacA的基因存在所有菌株中，但只有50％-60％菌株表达，感染者是否出现临床症状与感染菌株的毒力有关。因此诊断VacA产毒株感染在临床上具有重要意义，针对VacA的防治措施也具有重要价值。

编码vacA基因的DNA大约3.8kb。Atherton等发现Hp的vacA基因内存在三种不同的信号区序列(s1a，s1b，s2)和两种不同的中间区序列(m1，m2)，据此可将Hp分为不同的vacA基因亚型。vacA基因型有很强的地区差异性，研究表明我国基因型大多为s1m2型。纪徐准等对五株有代表性的中国Hp菌株进行vacA基因测序，然后用比较基因序列差异距离的方法分析，发现四株中国m2型vacA基因彼此相似，其基因差异距离明显不同于同型西方菌株。编码毒性亚单位及输出段的基因在中国菌株间彼此相似，而与西方菌株相比则形成独立的一组。由于vacA基因呈多态性，导致表达蛋白结构的差异。因此针对中国株的vacA基因产物用于诊断和防治更适合国内临床。

现有技术已成功地表达了VacA重组蛋白，并鉴定其具有良好的抗原性与免疫原性，由于制备方法的烦琐及各种影响因素的存在，目前尚未制备出重组VacA单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的是(1)：提供一种能持续稳定分泌幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体的杂交瘤细胞系ZYA2、ZYB5、ZYC8、ZYD4及一种利用该杂交瘤细胞用同系小鼠体内诱生法获得的抗幽门螺杆菌重组VacA蛋白的单克隆抗体(针对中国株的重组VacA单克隆抗体)。(2)、提供该单克隆抗体在制备诊断VacA阳性株感染的ELISA试剂盒中的应用以及幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体在制备相应疫苗和治疗VacA阳性株感染的试剂中的应用。

采用的具体技术方案如下：

一种能持续稳定分泌幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体的杂交瘤细胞系ZYA2、ZYB5、ZYC8、ZYD4，它们由以下步骤制得：采用基因工程诱导表达获取的幽门螺杆菌VacA重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的脾细胞、活性大于95％的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，克隆筛选能持续稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

所述免疫小鼠脾细胞与活性大于95％的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞按10：1比例进行细胞融合，细胞融合时所用促进剂PEG的分子量是4000，浓度是50％，细胞融合后置于96孔板中培养。

在其制备步骤中于杂交瘤细胞融合后7-10天开始检测培养上清中的抗体。