[发明专利]检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒的检测方法，尤其涉及一种同时检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量PCR方法，属于生物技术领域。

背景技术

猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV)、猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)、II型猪圆环病毒(Porcine circoviruses，PCV2)、猪瘟病毒(Hog choleravirus，HCV)等都属于猪呼吸道病和繁殖障碍综合症病原，并且4种病毒常出现混合感染。PCV-2还与猪呼吸道病综合症(Porcine respiratory disease complex，PRDC)、断乳仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)和猪皮炎和肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)等均具有密切的相关性，是引起多种综合症的重要原发病原(Segales J，Allan GM，DomingoM.Porcine circovirus diseases.Anim Health Res Rev.2005 Dec；6(2)：119-42；Lipej Z，Segales J，Toplak I，et al.Postweaning multisystemic wasting syndrome(PMWS)in pigsin Croatia：detection and characterisation of porcine circovirus type 2(PCV2).Acta VetHung.2005；53(3)：385-96；Sipos W，Duvigneau JC，Pietschmann P，et al.Porcinedermatitis and nephropathy syndrome(PDNS)is associated with a systemic cvtokineexpression profile indicative of proinflammation and a Th1 bias.Vet ImmunolImmunopathol.2005 Sep 15；107(3-4)：303-13；Kim J，Chung HK，Chae C.Association ofporcine circovirus 2 with porcine respiratory disease complex.Vet J.2003Nov；166(3)：251-6.)，PRV引起乳猪患病死亡率高达100％。反刍动物发病无药治疗，均已死亡告终；猪瘟遍布于全世界，具有高度接触传染性，是国际兽医局明列的A类15种法定传染病之一；PPV于1966年进行猪瘟病毒组织培养时发现的，是猪繁殖障碍的重要病原。

目前，检测各种病毒的方法很多，如检测PRV潜伏感染的方法有血清学试验、体内潜伏病毒的激活与检测、组织块培养和共培养技术、核酸杂交和常规PCR检测技术，其中常规PCR检测技术敏感性、特异性、稳定性和可操作性都比较好，但常规PCR反应后的处理存在交叉污染和EB等对操作者的危害。而实时荧光定量PCR检测技术就填补了以上的缺陷，无论是在研究中还是在临床样品的检测上，实时荧光定量PCR快速、敏感的特性使它成为应用于检测微生物的有效方法(Kim J，ChungHK，Chae C.Association of porcine circovirus 2 with porcine respiratory diseasecomplex.Vet J.2003Nov；166(3)：251-6.)，实时荧光定量PCR比较以往的荧光抗体试验FA、IPMA法、以及病毒分离法，具有更加快速、敏感、安全的特点。其检测的灵敏度优于传统检测方法(Kim J，Chung HK，Chae C.Association of porcinecircovirus 2 with porcine respiratory disease complex.Vet J.2003Nov；166(3)：251-6.)，比较PCR法敏感性达10-100倍(Gunson RN，Collins TC，Carman WF.Practicalexperience of high throughput real time PCR in the routine diagnostic virology setting.JClin Virol.2006 Apr；35(4)：355-67.Epub 2006 Feb 7)。