[发明专利]表达传染性法氏囊病毒VP2基因编码蛋白永生化细胞制备方法

权利要求书

1.一种表达传染性法氏囊病毒VP2基因编码蛋白永生化细胞制备方法，其特征在于它的步骤如下：

1)自传染性法氏囊病毒抽提病毒RNA，长距离一步法RT-PCR扩增病毒全长cDNA，并以此为模板PCR扩增VP2基因片段与哺乳动物细胞真核表达pCI-neo构建表达质粒pCI-neo-VP2，经42℃热击转化CaCl₂法制备的大肠杆菌Top10感受态细胞；

2)用Luria-Bertani Medium作为基础培养基，各培养1-3ml浓度为1-1.5 OD₆₀₀值的含目的基因重组质粒的菌液，通过超纯质粒纯化试剂盒制备无内毒素的超纯质粒；

3)用含10-15％小牛血清的Minimum Essential Medium作为基础培养基，各重组质粒经Opti-MEM稀释后在Lipofectamine 2000介导下转染90-95％融合的生长活力旺盛的单层Vero细胞；

4)在含500μg/ml浓度G418的Minimum Essential Medium培养基中，通过极限稀释法获得单克隆化细胞；

5)单克隆化细胞经PCR、RT-PCR、Southern blot、Northern blot和IFA/IPMA检测后，获得含有目的基因的永生化细胞。

2.根据权利要求1所述的一种表达传染性法氏囊病毒VP2基因编码蛋白永生化细胞制备方法，其特征在于所述的VP2基因与含有CMV启动子的真核表达载体pCI-neo组建成表达载体pCI-neo-VP2。

3.根据权利要求2所述的一种表达传染性法氏囊病毒VP2基因编码蛋白永生化细胞制备方法，其特征在于所述的pCI-neo-VP2重组质粒，经42℃热击转化CaCl₂法制备的大肠杆菌Top10感受态细胞后，构建含上述表达质粒的大肠杆菌。

4.根据权利要求3所述的一种表达传染性法氏囊病毒VP2基因编码蛋白永生化细胞制备方法，其特征在于所述的含目的基因的大肠杆菌经过质粒超纯纯化后，在Lipofectamine 2000介导下转染生长活力旺盛的单层Vero细胞，相应的传染性法氏囊病毒基因编码蛋白的以独立形式沉积在细胞内。

5.根据权利要求4所述的一种表达传染性法氏囊病毒VP2基因编码蛋白永生化细胞制备方法，其特征在于所述的含目的基因的重组质粒转染后的细胞进行G418抗性筛选，获得G418抗性的细胞。

6.根据权利4或5要求所述的一种表达传染性法氏囊病毒VP2基因编码蛋白永生化细胞制备方法，其特征在于所述的G418抗性的细胞，通过极限稀释法获得单克隆化细胞。

7.根据权利要求6所述的一种表达传染性法氏囊病毒VP2基因编码蛋白永生化细胞制备方法，其特征在于所述的单克隆化细胞，在含500μg/ml浓度G418的Minimum Essential Medium培养基中传代、扩繁，经过PCR、RT-PCR、Southernblot、Northern blot和IFA/IPMA检测后，获得含有目的基因的单克隆永生化细胞。

8.根据权利要求7所述的一种表达传染性法氏囊病毒VP2基因编码蛋白永生化细胞制备方法，其特征在于所述的获得含有目的基因的单克隆永生化细胞为研究传染性法氏囊病毒基因编码蛋白对宿主细胞基因表达调控提供载体，以及表达传染性法氏囊病毒VP2基因编码蛋白应用于传染性法氏囊病的免疫接种。