[发明专利]用二次谐波和双光子激发荧光实现高空间分辨视网膜成像的方法

说明书

技术领域

本发明将二次谐波成像、偏振敏感二次谐波成像以及双光子激发荧光成像相结合，对视网膜进行高空间分辨成像，以实现眼底疾病的早期诊断。由于视网膜各细胞层在结构及光学性质上各异，利用这种成像方法不仅能够根据视网膜细胞层各自的特点采用相应的成像手段，而且能够对同一细胞层进行多种成像方法的复合测量，从而获得互补的功能信息。因此，本发明将为各类视网膜疾病的早期诊断以及视觉科学的研究提供一种新型的具有三维高空间分辨率的视网膜单细胞成像手段，对降低视网膜患者的失明风险具有重要意义。

背景技术

视觉科学的研究以及眼科临床上对各类视网膜疾病的早期诊断，要求发展新型的具有更高空间分辨率、可三维成像、灵敏度高、能够获取视网膜组织功能信息的成像手段。将自适应光学技术与具有高空间分辨率并能够提供更多新型功能对比信息的成像方法相结合是新一代视网膜成像技术的发展方向，而发展一种能满足视网膜成像特殊要求的具有高空间分辨率的光学成像技术是实现这一目标的关键。

目前已在临床获得应用或正在发展的视网膜成像手段包括激光扫描共焦成像、光学相干层析成像以及眼底自体荧光成像等。双光子激发荧光和二次谐波是近几年来发展起来的并在生物医学领域获得广泛应用的新型成像技术，具有高空间分辨率、灵敏度高、特异性好以及对样品损伤小等优点，有望在新一代视网膜成像设备中获得应用。

双光子激发荧光可以显著提高荧光成像的穿透深度，避免紫外光对视网膜的损伤。由于双光子激发的吸收谱很宽，利用单一光源可以激发视网膜内不同的荧光团，而且可以很好地解决荧光探测中的光谱交叠问题。在色素上皮细胞层主要有两种自体荧光团，即脂褐素和黑色脂褐素。研究表明，这些荧光团在色素上皮细胞层的集聚和分布与年龄以及视网膜疾病有关。因此采用双光子激发视网膜色素上皮细胞层的自体荧光成像可以为眼疾病的病理研究和早期诊断提供方法和依据。

二次谐波成像是近年迅速发展并引起生物医学界关注的一种新型高分辨光学成像方法。与双光子激发荧光相同，二次谐波也是二阶非线性过程，因此具有双光子荧光成像的优点。但与双光子荧光相比，二次谐波成像的独特之处在于信号光的空间分布与微观结构有关，并且对分子排列敏感，具有很高的三维空间分辨能力。因此，二次谐波成像已经被用于细胞膜、细胞和组织等各类生物体系的活体观察，如有丝分裂细胞中的纺锤体和微丝微管。对于成层状分布的视网膜感光细胞阵列，二次谐波是一种很好的观测手段，可以对感光细胞的细胞膜成像，研究细胞的分布密度；借助于染料还可测量细胞膜的膜电位，进行细胞的功能成像。另外，二次谐波具有偏振敏感特性，对于神经节细胞层的成像具有重要的意义。当偏振激发光通过微丝状的神经节细胞的轴突传输并反射回探测器时，其偏振态发生变化，改变的大小取决于光所通过的微丝的数量，因此通过测量反射光的偏振态改变，就可以得到神经节细胞层的厚度，判定视神经细胞的丢失多少。

本发明是一种用二次谐波和双光子激发荧光实现高空间分辨视网膜成像的新方法，有望在视网膜疾病的早期诊断以及视觉科学研究中发挥巨大作用。

发明内容

本发明通过光路系统、机械系统以及电子学系统的特殊设计，将超短脉冲激光器和激光扫描共焦检眼镜相耦合，利用检眼镜对人眼视网膜检查的同时，获取二次谐波信号、偏振敏感二次谐波信号以及双光子激发荧光信号。采用计算机处理与控制系统得到视网膜各细胞层图像，并与激光扫描共焦检眼镜产生的视网膜反射图像形成对比信息。

本发明主要针对视网膜三个重要功能的细胞层：色素上皮细胞层、感光细胞层以及神经节细胞层，分别进行双光子激发荧光成像、二次谐波成像以及偏振敏感二次谐波成像，通过计算机处理与控制系统得到视网膜三个重要功能细胞层的图像。

本发明可对视网膜三个重要功能细胞层的各细胞层，进行二次谐波成像、偏振敏感二次谐波成像、双光子激发荧光成像的复合测量。通过计算机处理与控制系统得到视网膜三个重要功能细胞层的各细胞层的二次谐波与双光子激发荧光的合成图像或偏振敏感二次谐波与双光子激发荧光的合成图像或二次谐波与偏振敏感二次谐波的合成图像或二次谐波、偏振敏感二次谐波与双光子激发荧光的合成图像，从而获得同一细胞层的互补功能信息。