[发明专利]以云母为衬底的DNA样品制备方法

说明书

技术领域

本发明属于显微技术，具体涉及原子力显微镜(AtomicForceMicroscopy， 简称AFM)观测DNA所用样品的制备方法。

背景技术

1982年，宾尼(Binnig)等人发明了扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscopy，SPM)，它是一类可以从原子水平到纳米尺寸观察物质结构的三维成 像工具，是一种新型的显微技术。1986年宾尼(Binnig)与魁特(Calvin F.Quate) 和盖博(Christoph Gerber)合作推出了原子力显微镜(Atomic Force Microscopy， 简称AFM)。AFM在观测生物样品方面有着独特的优势，例如：可以在近似生理环 境下直接观测生物样品；在扫描样品过程中将针尖对样品的作用力控制在 10^-9-10^-12N，使针尖对样品的损伤降低到非常低的水平；AFM样品制备突破了导电 性的限制，与电子显微镜相比制样过程相对简单。因此，AFM出现以后在生物研 究中迅速得到了广泛应用。

在各类AFM应用中，最为关键的一步无疑是DNA样品的制备，制样的好坏将 决定整个实验的成败。现在，国内外各个实验室的DNA样品制备方法各种各样， 无论是衬底的选择，还是DNA样品的浓度，以及制样的细节等都各不相同。国内 外应用比较广泛的主要有两大类DNA制样方法：一是对云母表面进行修饰，所用 的试剂有3-氨丙基三乙氧基(简称APS)，戊二醛，亚精胺以及用阳离子进行预 处理等；二是在DNA水溶液中加入阳离子，但是各家所使用的阳离子种类及浓度 都不相同。在第二种方法中，阳离子和DNA的浓度是决定制样成败的关键，比如， 阳离子浓度太大，容易使DNA分子相互结合在一起而不能均匀分散在云母片上； DNA的数量太少，对于要做大量统计的实验显然不利；DNA太多以至于不同分子 之间有重叠，对长度的测量也不利。

技术方案

下面将针对现有制膜技术的缺陷，提供一种适于对质粒DNA及其碎片进行 长度测量并进行大量统计分析的要求的制样方法。

本发明所提供的AFM的DNA样品制备方法，由如下步骤组成：

用蒸馏水和Mgcl₂溶液将原始DNA样品稀释成DNA溶液；

在涡旋震荡器上震荡2-3分钟，使得样品在溶液中分散均匀；

取4-5μl的样品滴于新解理的云母上，沉积5-10分钟；

用四次蒸馏水冲洗7-12次，每次水的体积大约在120-160μl左右；

⑤放置在空气中大约6-7小时后再进行观测。

其关键技术在于：步骤1中，DNA浓度为1-3ng/μl，Mg²⁺浓度为1-4mM。

为了保证整个操作过程中不引入杂质，所用的蒸馏水为四次蒸馏水。

使用本发明提供的方法所制出的样品，经AFM成像后，不但能够在较高的 图像分辨情况下真实地显现DNA的形态，而且DNA及碎片的数量也较为适中，适 合于进行DNA及其碎片长度的测量并做统计分析。

实施例

下面将用具体的实施例对本发明的技术方案作进一步阐述。

实施例1

实验设备与材料：上海爱建纳米公司生产的AJ-III型原子力显微镜，在室 温下以Tapping mode在空气中成像，相对湿度为33％-39％，所有图像采集的扫 描速度为1.5Hz，像素为256×256；针尖选用俄罗斯MikroMasch公司的型号为 NSC11的硅针，共振频率为315KHz，力常数为48N/m；云母为中国科学院上海原 子核研究所提供；PUC19DNA购于大连宝生物工程有限公司，长度为2686bp，含 有70％以上的共价闭环。

DNA样品制备流程如下：

用四次蒸馏水和Mgcl₂溶液将原始DNA样品稀释成DNA浓度为1ng/μl，Mg²⁺浓 度为1mM的溶液；

在涡旋震荡器上震荡2-3分钟，使得样品在溶液中分散均匀；

取4-5μl的样品滴于新解理的云母上，沉积5-10分钟；

用四次蒸馏水冲洗7-12次，每次水的体积大约在120-160μl左右效果最好；

⑤放置在空气中大约6-7小时以上再进行观测。