[发明专利]表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组乳酸乳球菌及制法

权利要求书

1、一种表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组乳酸乳球菌，其特征是：它是保藏在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 207020的重组乳酸乳球菌。

2、一种如权利要求1所述的表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组乳酸乳球菌的制法，其特征是：

(1)TGEV S基因乳酸乳球菌表达载体的构建

以质粒pUC-S为模板，以TS7和TS8为引物扩增含有TGEV S基因A、B、C、D 4个主要抗原位点的2007bp目的片段，命名为Sa，Sa基因与pNZ8112载体质粒进行酶切、连接并经电转化转入感受态细胞NZ9000，获得含有重组质粒的乳酸乳球菌命名为Lactococcus lactis NZ9000/pNZ8112-Sa/NZ9000；所述的引物序列为：

(2)TGEV S蛋白在乳酸乳球菌中的诱导表达

pNZ8112-Sa/NZ9000阳性重组菌及pNZ8112/NZ9000空质粒对照菌，接种于GM17液体培养基中，30℃厌氧培养过夜后，取过夜培养物以体积比1∶25比例接种于20ml培养基中进行扩增培养，30℃培养至OD₆₀₀为0.4；取10ml细菌培养液用质量浓度1ng/ml的乳链杆菌肽Nisin诱导2-3h；终止培养后分别取出1ml样品经溶菌酶处理后进行SDS-PAGE及Western-blot分析；

(3)间接免疫荧光检测

取12小时培养的阳性重组菌和空载体对照菌液体培养物0.5mL离心去上清后，分别用磷酸盐缓冲液PBS低速离心洗三次，加入兔源抗TGEV抗血清，悬浮混合后37℃作用30分钟，离心去上清，PBS离心洗菌体三次，加入稀释的含有伊文思蓝的抗兔异硫氰酸荧光素荧光标记二抗，悬浮混合后37℃作用30分钟，离心去上清，PBS离心洗菌体三次，菌体沉淀物悬浮在200μl PBS，取适量涂片，自然干燥后，冷丙酮固定30min，干燥后荧光显微镜观察。