[发明专利]天山雪莲sikSACPD基因在培育抗寒植物中的应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种从菊科凤毛菊属植物分离得到sikSACPD基因，并利用其对农作物品种进行改良，增强作物品种的抗寒性能，尤其是一种从天山雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir)叶片全长cDNA文库，用简并引物获得特异性片段，在文库中获得硬脂酰ACPΔ⁹脱饱和酶SACPD基因(全长1555bp)，并将其用于农作物品种改良，增强作物品种的抗寒性能。

背景技术：

低温是限制植物地理分布及生物产量的重要因素，也是危害农业生产的主要自然灾害之一。生物膜是细胞与外界环境联系的界面，各种逆境对细胞的伤害始于质膜。1973年，Lyons根据细胞膜结构与抗冷性的关系，首先提出了植物冷害的“膜伤害”假说。他指出生物膜由于其结构物质的特点，会随温度的降低而产生物相变化，这些变化又引起胞内离子渗漏，胞内离子失去平衡，膜结合酶和游离酶活力失调。继而使细胞代谢失调，有毒的中间代谢物累积，使植物细胞受害[Chilling injury in plants[J].Ann Rev Plant Physiol 1973(24)：445-466]。

近年来，随着植物生理、细胞和分子生物学理论和方法的日益完善，植物冷驯化和抗寒分子机理的研究取得了显著进展，植物抗寒基因工程也得到迅速发展，并研究出了多种转基因抗寒植物，为培育抗寒植物开辟了新途径。

膜是低温伤害的原初位点。许多研究表明，细胞膜的相变温度越低，抗寒性就越强，降低植物的膜相变温度可以增强植物的抗寒性。而膜的相变温度高低与膜脂所含脂肪酸的饱和程度最为密切。不饱和度高，相变温度就低，抗寒性强。因此导入脂肪酸去饱和代谢关键酶基因，通过降低脂肪酸的饱和度，可以提高植物的抗寒性。

Kodama(1994)将拟南芥叶绿体中ω3脂肪酸脱氢酶基因fad7导入烟草中，所获得转基因烟草抗寒性增加(Plant Physiol，107(4)：1177-1185)。

Ishizaki-Nishizawa(1996)等将从蓝细菌(Anacystisnidukans)中克隆的Δ⁹去氢酶的基因Des9转入到烟草后，发现转基因烟草中受修饰的Δ⁹单饱和脂肪酸的含量与野生型相比增加了16倍，植物的半致死温度(LT50)也明显降低(Low temperature resistance of higher plants issignificantly enhanced by a nonspecific cyanobacterial desaturase.Nature Biotech 14：1003-1006)。

另外，酵母的硬脂酰基辅酶A去饱和酶基因和菠菜的硬脂酰基载体蛋白去饱和酶基因增强了转基因烟草的抗寒性。这些结果都表明导入脂肪酸去饱和代谢酶基因途径在抗寒上有潜力。

最近几年对低温调节代谢基因表达的研究更是在分子水平上证明了膜脂不饱和脂肪酸在植物进入抗寒状态中的重要性。耐冷的蓝藻从36℃转到22℃继续培养时，一种催化油酸到亚油酸反应(18:1^Δ9→18:2^Δ9，12)的酶基因desA表达增强，在高等植物中已发现了低温专一诱导表达的ω³脂肪酸去饱和酶基因fad8，此外在许多植物中发现可溶性蛋白质含量与抗寒性之间有密切关系，可能是植物在低温下只有促进活跃的蛋白质合成才能有可能提高抗寒性。脂类转移的蛋白质(lipid transfer protein，LTP)在不同细胞间起脂载体作用，已在许多植物中发现，它的活性受低温影响，而它的活性的改变将影响膜脂的组分，进一步影响抗冷力的表达。

此外将拟南芥的编码ω³脂肪酸去饱和酶的fad基因(Plant Physiol，105：601-605)，菠菜的硬脂酰基载体蛋白去饱和酶SAD基因分别导入烟草中，都增强了转基因烟草的抗寒性(Identification Of nucleotide-binding regions in the chaperonin proteins GroEL and GroES.Nature366：279-282)。

现已有多种脂肪酸去饱和代谢关键酶基因被相继发现，这为进一步开展抗寒基因工程奠定了基础。这些研究在分子水平上更精细地表明了脂类代谢在植物进入抗寒状态时的变化及这些变化产生的生理意义，同时也为抗寒基因工程提供了契机。