[发明专利]斑节对虾细胞周期蛋白B的基因序列

说明书

技术领域

本发明涉及一种斑节对虾细胞周期蛋白B基因序列。

背景技术

细胞周期是指连续分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历的整个过程。在这个过程中，细胞遗传物质复制并加倍，且在分裂结束时平均分配到两个子细胞中去。细胞周期又可以分为间期和有丝分裂期。从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂开始的时期就是间期。这一期以DNA合成为标志，经过分裂期，加倍的染色体和其他细胞组分被平均分配到两个完全一样的子细胞中。通过分裂，形成了一个新细胞。细胞周期能够严格按照间期到有丝分裂期的顺序运转是与相关调控基因的有序表达分不开的。这一基因可以诱导未成熟细胞进入有丝分裂期，并发现在有丝分裂期唯一需要合成的基因蛋白就是这个周期蛋白，这是一个起关键作用的细胞分裂的调节蛋白。

细胞周期蛋白B为有丝分裂期周期蛋白，在间期到有丝分裂期交界处发挥功能，诱导细胞分裂。细胞周期蛋白与细胞衰老关系密切，细胞周期蛋白B降解受阻，细胞不能退出有丝分裂期，影响细胞衰老。

发明内容

本发明的目的是提供一种斑节对虾细胞周期蛋白B的基因序列，其可促进鱼虾体细胞发育，缩短鱼虾类发育周期。

本发明是通过以近源物种细胞周期蛋白B的基因的CDS序列的保守区设计的兼并引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到斑节对虾细胞周期蛋白B的基因的全表达序列。

本发明从GenBank中下载近源物种(如人、牛、斑马鱼、日本对虾等)细胞周期蛋白B同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为225bp。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成得到以下引物序列：

F：5’ATWGCWAGYAAATAYGAAGARATGTA 3’

R：5’TCCATIARRTAYTTKGCWARIGTATG 3’。

提取斑节对虾总RNA，使之与反转录引物(oligo-dT接头引物)混合，进行反转录，合成第一链cDNA作为模板。用上述兼并引物进行PCR扩增，所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。

根据已得到的第一链cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3′和5′末端进行PCR扩增。在3′端的快速扩增中，由基因引物和接头引物进行PCR反应，扩增片段大小约为1000bp。所述的基因引物和接头引物序列为：

基因引物：5’TCGGGGACTTCGCATACATC 3’

接头引物：5’GGCCACGCGACTAGTAC 3’。

经3′端的快速扩增后的序列进行5′端的快速扩增，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和oligodG进行第一次PCR扩增，所得PCR产物再利用内侧引物和oligodG进行第二次PCR扩增。所述引物序列为：

oligo-dG：5’GGGGGGGGGGGGGGGH 3’

基因外侧引物：5’GCAAAGGTATGTTGAGAAGC 3’

基因内侧引物：5’GTGTAAGGGAAGGGGATAGG 3’。

经末端快速扩增技术进行PCR所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用M13引物对质粒DNA进行测序，测序所得序列再与兼并引物扩增所得的序列利用Clustal W软件进行拼接即可得到目的基因。

通过对细胞周期蛋白B基因的克隆，了解基因的组成情况及鱼类生长发育周期过程，并通过对该基因纯化蛋白的获得，可以促进鱼体细胞发育，缩短鱼类发育周期，对提高经济效益有一定的促进作用。

附图说明

图1为本发明在卵巢不同发育时期的表达；

First：卵巢发育第一阶段(卵巢还未发育)；Second：卵巢发育第二阶段(卵巢开始启动发育)；Fourth：卵巢发育第四阶段(卵巢发育完成，准备终止)；cyclin B：细胞周期蛋白B。

具体实施方式