[发明专利]家蚕微孢子虫水通道蛋白基因

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种来自于家蚕微孢子虫膜上的具有专性通水活性的水通道蛋白基因。

背景技术

微孢子虫(Microsporidia)隶属于原生生物界(Protista)、微孢子虫门(Microspora)(Levine and Corliss 1980)，近期研究表明微孢子虫在进化上与真菌有着紧密的亲缘关系，被NCBI正式确定为真菌类。微孢子虫近150个属1200余种，是专营细胞内寄生、缺乏线粒体，具有强烈抗性的孢子，通过极管刺入宿主组织细胞后将其孢原质注入细胞以寄生大量增殖，最终破坏宿主组织。它能广泛寄生感染无脊椎动物和脊椎动物，尤其是极具经济价值的昆虫、鱼类、啮齿类、兔类、皮毛动物、灵长类以及家庭宠物如狗和鸟，引发严重疾病甚至死亡。其中家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)，能经食下和胚种途径寄生于家蚕，引发严重的传染性微粒子病，最终导致家蚕大规模死亡，给世界蚕业造成巨大的经济损失，成为近100年来影响蚕业生产的难题。另外新发现，许多属的微孢子虫与人类疾病有关，如角膜病、表面角膜结膜炎、呼吸疾病、前列腺肥大和扩散感染、肝炎、脑炎、痢疾、肌炎、胆管炎等等，甚至还能机会性地感染艾滋病(HIV)患者、器官移植病人、服用免疫抑制剂药物病人和先天性免疫机能不健全者，引起呼吸系统、泌尿系统和皮肽溃烂等恶性疾病，加剧病情，加速病人的死亡。

对于微孢子的治疗，已有报道，如烟曲霉素及它的衍生物抑制甲硫氨酸胺基肽酶2的活性，正像阿苯达唑和苯并咪唑能够束缚微管蛋白一样，它们被鉴定为治疗微孢子的有用试剂，然而，对于治疗感染人类的多种微孢子仍没有找到有效、安全的药物试剂。

微孢子能够产生一种感染性的，能够抵制环境的孢子，孢子弹出内部极丝并将其内含物接种到临近宿主细胞。孢子发芽机制一直吸引着微孢子研究者们，自然地，抑制孢子发芽过程将成为一个有效的抗微孢子治疗方法。发芽刺激是可变的，但是，Weiss等推测，双糖海藻糖被水解成葡萄糖和它的代谢产物，从而产生孢内压力和渗透膨胀，导致极丝的排出。K.Ghosh等(2006)报道兔炎脑孢子的跨膜通道-水通道对水有高度渗透性，对溶质甘油或者尿素没有渗透性，而且试验发现它对汞不敏感。微孢子虫的水通道蛋白和它潜在的抑制剂将成为微孢子虫感染的新的治疗因素。虽然国内外对微孢子蛋白的研究较多，但是，到目前为止，尚无对家蚕微孢子虫水通道蛋白基因的研究报道。

发明内容

本发明拟基于基因组分析数据，提供一种家蚕微孢子原虫水通道蛋白基因。本发明不仅对于蚕业生产意义重大，而且对于推动微孢子虫家族的基础研究、对于医疗保健和农林业害虫生物防治等均具有重要意义。本发明申请人通过对家蚕微孢子虫水通道蛋白基因的克隆，得到了该蛋白基因的编码序列，具体方法如下：

(1)引物设计：根据家蚕微孢子虫的9倍基因组数据，搜索到水通道蛋白基因编码序列CDS，利用引物设计软件Primer 5.0进行引物设计，在正向引物加入BamH I酶切位点，在反向引物加入Sal I酶切位点，引物序列分别为：

NbAQP-primer-F：5’-CGGGATCCATGGTATCAAGAAATATATTAAA-3’

NbAQP-primer-R：5’-CGGTCGACATAAAGCTTGTACAAAATCGTG-3’

(2)NbAQP基因PCR扩增：由于微孢子虫基因组的高度简化特点，内含子很少，基因组序列数据显示该AQP基因不含内含子，故利用提取的微孢子基因组直接作为模板，采用基因组PCR扩增目的片段，扩增片段长度为763bp，基因CDS长度为747bp；

(3)NbAQP基因克隆：NbAQP扩增片段克隆到pMD18-T(TaKaRa)载体上，然后进行序列测定(上海英俊)，从而获得NbAQP的全长编码序列；

(4)序列同源性分析：将家蚕微孢子虫水通道类似蛋白与NCBI数据库所登录的蛋白质库同源比对分析，表明NbAQP与脑孢虫和人具有最高的同源性，分别是39％和31％。同时，根据与已研究验证的EcAQP、DdAQPA、HUMAQP1和AQP2氨基酸序列比对分析，该蛋白具有水通道蛋白典型的NPA基元；另外，因其第二个NPA基元前的第三个氨基酸不是半胱氨酸，推测该NbAQP可能同样对汞化合物不具敏感性，而且具有对水离子专一选择渗透性；该蛋白分子量为26.651kDa，等电点为5.145，无信号肽，同时具有7个跨膜区，而现已报道的同源蛋白一般具有6个跨膜区，具有水通道蛋白典型的NPA基元。