[发明专利]家蚕PIWI基因

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及Argonaute蛋白家族中一个与维持生殖细胞基因组遗传稳定性的PIWI基因。

背景技术

Argonaute蛋白家族是RNA调节的基因沉默的核心组成部分，其利用短的引导性RNA对特异目标核酸的功能行使进行调控。目前，与Ago类蛋白结合的小RNA中，研究得最为清楚的是miRNA和siRNA，二者在转录及转录后对基因表达进行调控。Ago类蛋白含有PAZ和PIWI两类标志性功能域。PAZ功能域是单链核酸的结合功能域，而PIWI功能域具有一个RNase H的折叠。这些功能域明确显示Ago类蛋白行使着RNA结合体的功能。进化分析显示Ago蛋白可以分为两大亚家族：Ago亚家族和Piwi亚家族。在RNA干扰机制研究中，对于Ago亚家族的研究已经取得了一些明显的进展。然而，对于Piwi亚家族的研究却一直处于落后的状态。

最近，Piwi类蛋白被发现与一类与miRNA和siRNA均不同的小RNA能够结合，这些小RNA在是重复相关的小RNA，而且在精巢及早期发育胚子中明显富积，研究表明这类小RNA来源于反转座子及其他重复元件，与Piwi类蛋白一起，参与生殖细胞及干细胞中重复元件的沉默，维持其基因组的稳定性。这一研究发现使得Piwi蛋白的研究迅速成为人们广泛关注的热点。

家蚕是鳞翅目昆虫的代表，随着全基因组序列的获得，在各方面的研究都获得了长足的进步。但对于家蚕干扰机制的研究以及基因组稳定性研究目前还几乎是空白。家蚕是否存在保守的干扰机制，其生殖细胞基因组的维持以怎样一种方式维持，目前尚无相关研究报道。

发明内容

本发明以家蚕全基因组序列为基础，目的在于提供一种家蚕Piwi基因，并进一步探索其在家蚕生殖细胞某些特定功能方面所起的作用，进而为理论研究和生产实践服务。

根据已公布的其他物种Piwi类蛋白序列信息，对家蚕全基因组序列进行同源搜索，结合EST序列信息，成功找到了家蚕中的Piwi蛋白类似物一个，对其进行了克隆，并进行了表达特征分析，序列的高度保守性及基因表达特征强烈暗示此基因为家蚕的Piwi基因，参与生殖腺某些特定功能的行使之中。具体方法如下：

(1)目标序列获得及数据库建立

果蝇、人、老鼠等物种的核酸，蛋白序列及所有家蚕EST序列下载自美国国立生物技术信息中心网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，形成总EST库，基因组序列为本发明申请人与中国科学院北京基因组研究所采用鸟枪法共同测定；

(2)基因电子克隆

同源性比对采用从NCBI下载的BLAST(basic local alignment search tool)工具，采用DNASTAR中的Seqman进行电子延伸，多序列比对采用Clustalw(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html)，预测基因的外显子、内含子结构采用Sim4程序(http://gamay.univ-perp.fr/analyse_seq.sim4).得到可能的家蚕Piwi基因；

(3)家蚕Piwi类似物全长cDNA基因的获得

根据3’-RACE扩增的编码序列设计引物，扩增片段克隆到Pmd18-T(TAKARA)载体上，然后进行序列测定与拼接，从而获得Leonurin的全长cDNA基因；

(4)序列同源性分析

对翻译出的蛋白序列与其他物种的Piwi蛋白进行相似性比对，发现家蚕Piwi类似物在家蚕中具有高度保守性。

(5)家蚕Piwi类似物表达特征分析

根据家蚕全基因组组织芯片数据，对家蚕Piwi类似物表达特征进行了分析，发现Piwi在家蚕的生殖腺中高量富积，显示家蚕Piwi类似物在家蚕生殖细胞某些特定功能方面起着重要作用。

获得的家蚕Piwi类似物全长cDNA基因及其推断的氨基酸序列如下：

1    ATG TCA GAA CCG AGA GGT AGA GGA CGA GCT CGA GGA CGC GCT GGT  45

1     M   S   E   P   R   G   R   G   R   A   R   G   R   A   G   15

46   CGT GGT GGT GAT GGA GGC GGA CCA GCA CCA CGA CGT CCA GGG GAA  90