[发明专利]家蚕肽聚糖识别蛋白基因

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种来自于家蚕先天免疫识别受体、具有识别细菌胞壁肽聚糖并激活家蚕免疫系统和抗细菌的蛋白基因。

背景技术

我国早在5000年前就开始了家蚕饲养，是养蚕业的发源地。随着生物工程技术手段的不断发展，将提高对家蚕的综合利用水平。微生物细胞壁的组成成分是天然免疫的高效活化分子，这些分子如革兰氏阳性细菌的肽聚糖(peptidoglycan，PGN)。PGN是由氨基糖骨架和肽链组成的聚合物，其结构单元由β-(1，4)-连接的N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸二糖单位以及四肽亚单位和肽桥组成。亚肽单位和间肽桥上氨基酸组成及排列的不同，决定了肽聚糖种类的多样性。天然免疫系统通过在进化中高度保守的一系列模式识别受体，识别微生物表面保守分子模式，其中PGRPs是一种重要的模式识别受体，在抵抗病原体入侵的过程中发挥着重要作用。PGRPs家族成员有一个C端PGRP结构域，约有165个氨基酸，从昆虫到哺乳动物显示出高度的保守性。但在PGRP结构域之外，氨基酸序列差异较大。根据它们的结构，肽聚糖识别蛋白可以分为两个亚型，即长型肽聚糖识别蛋白(PGRP-L)和短型肽聚糖识别蛋白(PGRP-S)。昆虫的PGRP-L主要表达于血细胞，PGRP-S存在于血淋巴、表皮和内脏，在血细胞中也有少量的表达。其中有些PGRPs是组成性表达，也有一些PGRPs(主要是PGRP-L，但除了PGRP-LB以外)是诱导性表达，在细菌感染或注射PGN可上调其表达。

人的PGRPs中PGRP-L表达最广泛，除在肝和胎肝表达外，在横结肠、淋巴结、心脏、胸腺、胰、降结肠、胃和睾丸有低表达。PGRP-Iα除在食管高表达外，也在扁桃体和胸腺表达，而在胃、降结肠、直肠和脑也有极低水平表达。PGRP-Iβ仅在食管、扁桃体和胸腺中表达。PGRP-S在骨髓高表达，并在胎肝和白细胞低水平表达，在外周血中仅中性粒细胞表达。因为外周血中的中性粒细胞的“污染”作用，使PGRP-S有可能在脾和空肠中低水平表达，这可能就是导致大鼠脾中PGRP-S有低水平表达的原因。有趣的是，发现小鼠缺乏睡眠能够上调其PGRP的表达，这说明PGRP可能在睡眠的自我调节方面起到了一定的作用。酚氧化酶原级联反应是昆虫抗菌防御的一部分，模式识别受体是酚氧化酶原激活系统的启动者，当模式识别受体与微生物细胞壁成分结合后形成一复合物，该复合物激活酚氧化酶原的激活酶原，使其成为酚氧化酶原激活酶，酚氧化酶原激活酶使酚氧化酶原激活，成为有活性的酚氧化酶。酚氧化酶是一种含铜的氧化剂，能把含酚的底物氧化成醌，再经几步非酶促反应转化为黑色素，而黑色素对微生物是有毒性的。同时还能通过控制Rel家族转录因子Relish可诱导其抗菌肽的表达。所有的肽聚糖识别蛋白能结合肽聚糖和细菌，这表明PGRP在天然免疫中具有识别和杀灭细菌的重要意义。但是尽管PGRPs被命名为肽聚糖识别蛋白，它不仅仅识别肽聚糖或革兰氏阳性菌，还能识别其他一些分子。到日前为止，尚无有关家蚕肽聚糖识别蛋白基因的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种家蚕肽聚糖识别蛋白基因，利用PGRPs蛋白对细菌的明显杀灭作用，进一步培育家蚕抗性品种。

本发明申请人首先利用家蚕基因组数据库和EST数据库资源，完成了PGRPs基因的预测，提取经PGN诱导的家蚕五龄三天脂肪体RNA并和成CDNA，完成基因克隆和相关研究。具体方法如下：

(1)相关CDNA获得：五龄三天家蚕大造，经PGN诱导12小时后取脂肪体，冻存与液氮中保存；RNAiso reagent(TaKaRa)提取RNA，并合成CDNA；

(2)BmPGRPs基因ORF获得及克隆：依据家蚕基因组数据库和EST数据库，预测出PGRPs基因ORF，并设计引物，通过PCR扩增得到BmPGRPs基因片段，将扩增片段克隆到PMD18-T Simple Vector，然后进行序列验证；

(3)序列同源性分析：相似性比较在NCBI站点上用BLAST完成，BLAST分析表明，BmPGRPs基因比较保守，在家蚕相关研究中没有报道过，为一新基因；

(4)BmPGRPs基因蛋白表达和纯化：将PGRPs基因全长ORF片段克隆到原核表达载体Pet50上，并完成诱导表达；该蛋白在IPTG终浓度0.5mM、30℃诱导6h可得到可溶蛋白；将表达所得蛋白通过过柱等蛋白纯化方法，得到PGRPs基因蛋白。

上述方法获得的BmPGRPs基因全长ORF及其推断的氨基酸序列如下：