[发明专利]家蚕微孢子虫极丝蛋白PTP1基因

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种来自于家蚕微孢子虫的繁殖和侵染有关的家蚕微孢子虫极丝蛋白PTP1基因。

背景技术

微孢子虫是普遍分布于自然界的细胞内专性寄生原虫，近150个属1200余种，有着极为广泛的宿主，包括脊椎动物和无脊椎动物，是经济昆虫、鱼类、兔类、产毛动物、啮齿类及灵长类的致命病原。而家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)，分类地位属于原生动物门，单丝孢子虫亚门，微孢子虫纲。由微孢子虫寄生于经济昆虫家蚕而引起严重的传染性微粒子病，且由于微孢子原虫可以通过胚胎向下代传播，一直被养蚕国家和地区列为蚕业生产法定检疫对象。单就我国每年因带毒种和微粒子病而带来的直接经济损失即达上千万元以上。攻克微粒子病这一蚕丝业的顽症，是蚕业界的重点和难点研究领域。

微粒子病是由微孢子虫寄生宿主而引起的疾病。微孢子虫以其独特的侵染方式，广泛寄生并感染极具经济价值的昆虫、鱼类、啮齿类、兔类、皮毛动物、灵长类以及家庭宠物如狗和鸟，引发严重疾病甚至死亡，严重制约着世界蚕业生产和动物保育。甚至还能机会性地感染艾滋病(HIV)患者、器官移植病人、服用免疫抑制剂药物病人和先天性免疫机能不健全者，引起呼吸系统、泌尿系统和皮肤溃烂等恶性疾病，加剧病情，加速病人的死亡。100多年来，尽管已使用了多种化学药物进行治疗，如：咪唑类、烟曲霉素、歌咪啶碱、苯莱特、甲基托布津等等，但治疗效果并不理想，至今仍未发现有治疗微孢子虫病的特效药物。

极管是家蚕微孢子虫繁殖和侵染的重要器官，在家蚕微孢子虫对家蚕的侵染中起着关键性作用。极管长度一般在50～150μm，直径一般在0.1～0.2μm范围。极管具有柔韧性，在运送孢原质的过程中其管直径可以增加到0.4μm，孢原质运送完毕后其长度会缩短5～10％。在家蚕微孢子虫入侵过程中，极管在适当刺激后迅速弹出并“刺入”家蚕细胞中，同时将孢原质注入其细胞质，完成对家蚕的入侵。而其组成成分主要是蛋白，而极管蛋白PTP1是它主要的组成部分。极管蛋白PTP1是一种伴刀豆球蛋白，是极管的主要蛋白，在E.hellom中PTP1蛋白的含量占整个极管蛋白的70％。通过SDA-PAGE和银染分析PTP1发现，不同种类的微孢子虫的PTP1分子大小不等。对不同微孢子虫PTP1蛋白的研究表明，PTP1蛋白具有疏水性、高脯氨酸含量和免疫抗原性等诸如特征(Delbac et al.，1998)。而PTP2和PTP3也是构成极管的重要组分。有研究认为，在极管弹出过程中，PTP1和PTP2在孢子激活之前呈类结晶状蛋白质单体，发芽过程中在极管顶端形成聚合体，而PTP3通过调控PTP1-PTP2聚合体的构象状态影响极管的弹出。另外，极管蛋白PTP1的糖基化作用对极管的构造起着重要的作用，从而间接影响微孢子虫对宿主细胞的入侵。但是目前关于微孢子虫极管蛋白的研究仅局限于Encephalitozoon、Glugea、Ameson和Nosema等部分微孢子虫属的少量微孢子虫。

发明内容

本发明拟基于基因组分析数据，其目的在于提供一种家蚕微孢子虫极管蛋白PTP1基因。通过分析PTP1的功能、组成和特性，弄清极管蛋白PTP1在家蚕微孢子虫极管弹出过程中的作用，探明家蚕微孢子虫侵染宿主家蚕致病的机制，对生产实践和疾病防治具有极其重要的意义。

本发明申请人通过对家蚕微孢子虫极丝蛋白PTP1基因的克隆，得到了该蛋白基因的编码序列，具体方法如下：

(1)共线性分析：通过对家蚕微孢子虫与兔脑炎微孢子虫二者基因组上的排列情况，发现同源基因在基因组上的排列具有很强的相同性，即共线性；通过对兔脑炎微孢子虫第六条染色体与之具有同源性基因的家蚕微孢子虫的Superscaffold000055序列共线性分析，得到了编码家蚕微孢子虫极管蛋白PTP1基因序列CDS；

(2)引物设计：利用引物设计软件Primer 5.0进行引物设计，在正向引物加入BamHI酶切位点，在反向引物加入Sal I酶切位点，引物序列分别为：

PTP1-primer-F：5′-CGGGATCCATGGCATGTTCACCCGGAAAT-3′

PTP1-primer-R：5′-CGGTCGACGTTTAGCACACATGGATTATTGGC-3′

(3)极丝蛋白PTP1 PCR扩增和克隆：利用提取的微孢子基因组直接作为模板，采用基因组PCR扩增目的片段，将扩增片段克隆到pMD18-T(TaKaRa)载体上，然后进行序列测定(上海英俊)，从而获得的极丝蛋白PTP1全长编码序列；