[发明专利]Nipah病毒的引物和探针及一步法实时RT－PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明专利属于生物技术领域，涉及科研、临床和病毒流行病学监测等工作中使用RT-PCR方法对Nipah病毒RNA的检测和定量分析。具体是针对Nipah病毒的引物和探针及一步法实时RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

Nipah病毒与人类疾病

Nipah病毒(Nipah Virus，NiV)是近年来新出现的一种副粘病毒，可引起人和动物急性中枢神经系统病变。Nipah病毒感染于1998～1999年在马来西亚和新加坡首次爆发，最近在孟加拉国、泰国和印度也被发现。在人类，Nipah病毒引起热性脑炎并伴发呼吸系统症状，死亡率高。Nipah病毒的储存宿主被认为是果蝠，人类可通过与蝙蝠直接接触或与猪等中间宿主接触而被感染。然而Nipah病毒的病毒学特征和其在人群中传播的流行病学特点等相关问题仍不清楚。

Nipah病毒的检测

Nipah病毒的检测方法主要有以下几种：病毒分离与鉴定、血清中和试验(Serumneutralization test，SNT)、酶联免疫吸附检测(Enzyme-linked immunosorbentassays，ELISA)、PCR检测等。

病毒分离是病毒性脑炎最基础、最重要的诊断手段。对于新发疾病病例，病毒分离是最有价值的工作，但Nipah病毒分离需在生物安全4级(P4)条件下进行。血清中和试验(Serum neutralization test，SNT)和酶联免疫吸附检测(Enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)均为免疫学检测方法，敏感性高，但特异性较差，并存在一定的交叉反应。制备单克隆抗体可以增加特异性，但成本较高。PCR检测具有快速、准确的特点，也被广泛用于对Nipah病毒的检测。目前已经建立的PCR检测方法有：1)Guillaume等【Guillaume V，Lefeuvre A，FaureC，et al.Specific detection of Nipah virus using real-time RT-PCR(TaqMan).J Virol Methods，2004，120(2)：229-37】针对Nipah病毒N基因的Real time-PCR(Taqman荧光探针)检测方法，检测灵敏度能达1PFU的病毒量，该方法适合对自然感染样品或流行病学样本进行检测。2)Wacharapluesadee等【WacharapluesadeeS，Hemachudha，T，Duplex nested RT-PCR for detection of Nipah virus RNA fromurine specimens of bats.J.Virol.Methods，2006，doi：10.1016/j.jviromet.2006.11.023】建立了针对Nipah病毒N基因的Duplcxnest RT-PCR检测方法，用卡那霉素RNA质粒作为内参，同时扩增内参和Nipah病毒N基因，有效的避免了假阴性结果，检测限为0.37pg/ul，PCR检测的灵敏度进一步提高。

实时PCR(Real-time PCR)技术

实时PCR技术是近年来发展起来的一种新型的PCR技术，它是在传统PCR反应体系的基础上添加了荧光染料或具有荧光标记的探针，将荧光信号强弱与PCR扩增情况结合在一起，通过监测PCR反应管内荧光信号的变化来实时观测PCR反应进行的情况。实时PCR技术，解决了传统PCR难以对扩增起始模板的量进行测定的难题，避免了传统检测技术样本消耗量大，实验操作繁琐，检测灵敏度低等缺点，并具有快速、避免交叉污染等特点，可以在基因检测、基因表达、SNP分析等领域广泛应用。而TaqMan探针的采用，更增加了检测的特异性和结果的可靠性，是一种方便、快捷、经济的检测方法，尤其适用于科研、临床和病毒流行病学监测等工作。