[发明专利]Hendra病毒的引物和探针及一步法实时RT－PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明专利属于生物技术领域，涉及科研、临床和病毒流行病学监测等工作中使用RT-PCR方法对Hendra病毒RNA的检测和定量分析。具体是针对Hendra病毒的引物和探针及一步法实时RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

Hendra病毒与人类疾病

Hendra病毒(Hendra Virus，HeV)是近年来新出现的一种副粘病毒，可引起人和动物急性中枢神经系统和呼吸系统病变。Hendra病毒原称马麻疹病毒(equinemobil-livirUs，EMV)，是1994年在澳大利亚昆士兰州布里斯班附近首次发现的，1995年又在麦凯(Mackay)发生。两次共造成15匹赛马和2人死亡。主要表现为呼吸道症状，但在麦凯发生的先是出现神经症状。两次爆发后，当地再也没有出现新的病例，对各种动物的血清学调查均为阴性。研究认为Hendra病毒是一种水果蝙蝠病毒，其传染性比较低。它的传播方式目前尚不清楚，可能是通过被感染动物的组织液包括尿液的直接接触传播的。

Hendra病毒的检测

Hendra病毒的检测方法主要有以下几种：病毒分离与鉴定、血清中和试验(Serum neutralization test，SNT)、酶联免疫吸附检测(Enzyme-linkedimmunosorbent assays，ELISA)、PCR检测等。

病毒分离是病毒性脑炎最基础、最重要的诊断手段。对于新发疾病病例，病毒分离是最有价值的工作，但Hendra病毒分离需在生物安全4级(P4)条件下进行。血清中和试验(Serum neutralization test，SNT)和酶联免疫吸附检测(Enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)均为免疫学检测方法，敏感性高，但特异性较差，并存在一定的交叉反应。制备单克隆抗体可以增加特异性，但成本较高。PCR检测具有快速、准确的特点，且不需在P4实验室进行，可广泛用于对Hendra病毒的检测。目前已经建立的PCR检测方法有Smith等【Smith IL，HalpinK，warrilow D，et al.Development of a fluorogenic RT-PCR assay(TaqMan)forthe detection of Hendra virus.J Virol Mthods 2001，98：33-4】的针对HendraM基因的Real time PCR(Taqman探针)检测方法，检测灵敏度比常规RT-PCR高1000倍，该方法适合对自然感染样品或流行病学样本进行检测。

实时PCR(Real-time PCR)技术

实时PCR技术是近年来发展起来的一种新型的PCR技术，它是在传统PCR反应体系的基础上添加了荧光染料或具有荧光标记的探针，将荧光信号强弱与PCR扩增情况结合在一起，通过监测PCR反应管内荧光信号的变化来实时观测PCR反应进行的情况。实时PCR技术，解决了传统PCR难以对扩增起始模板的量进行测定的难题，避免了传统检测技术样本消耗量大，实验操作繁琐，检测灵敏度低等缺点，并具有快速、避免交叉污染等特点，可以在基因检测、基因表达、SNP分析等领域广泛应用。而TaqMan探针的采用，更增加了检测的特异性和结果的可靠性，是一种方便、快捷、经济的检测方法，尤其适用于科研、临床和病毒流行病学监测等工作。

但是，由于实时PCR技术具有很好的敏感性和特异性，因此容易出现假阳性和假阴性结果，所以实际应用时需要设置参照(Control)。通常的做法是检测目的基因的同时检测样本物种基因组中表达稳定的看家基因，如GAPDH、β-actin、16或18SrRNA等。这样就存在几个问题：1、由于不同物种的看家基因序列存在差异，所以检测不同物种目的基因时，需要对每一种物种设计看家基因的引物和探针，缺乏通用性，且增加实验操作的繁琐性和成本；2、对目的基因和看家基因分两管并行检测时，增加了试剂和人力的成本，也增加了交叉污染机会。如果在同一管检测则会因为两套引物和探针之间的相互作用而降低PCR反应效率，并增加了引物和探针的设计难度。

本发明设计一组引物及探针及相应的试剂盒，其中包括一对可以同时检测Hendra病毒和参照基因的引物和两条针对Hendra病毒和参照基因的TaqMan探针，使PCR反应体系中的引物和探针数量由通常的6条减少到4条，从而可以实现Hendra病毒和参照基因在同一管进行高效率的扩增，减少了实验试剂成本和操作步骤，并减少了PCR实验通常需要避免的污染机会，很好的避免了上述问题。

发明内容