[发明专利]一种茎－环型寡聚核苷酸探针

说明书

技术领域

本发明涉及一种核苷酸结构，具体涉及作为探针的核苷酸的结构。

背景技术

茎-环状寡核苷酸(stem-loop oligonucleotides)是分子生物学和生物技术领域的常用工具之一。与线性寡核苷酸相比，茎-环状寡核苷酸与靶分子的杂交或结合具有更高的特异性，并可以根据不同的应用需求灵活设计不同形式的茎-环状寡核苷酸，例如分子信标(molecular beacons)、抑制性聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、LUX(light upon extension)引物等。目前，茎-环状寡核苷酸已经以不同的形式应用于多种分子生物学技术，主要包括单核苷酸多态性检测、基因突变分析、实时荧光定量PCR和生物芯片等，充分展示和体现了茎-环状寡核苷酸在分子生物学和生物技术领域的应用前景。对于茎-环状寡核苷酸而言，它的茎部热力学稳定性是维持其自身二级结构稳定性的关键因素，因此，只要合理设计茎-环状寡核苷酸的碱基组成，就可以使靶分子能够在适当的反应条件下破坏茎-环状寡核苷酸的茎部稳定性，并使其二级结构解体，然后，就可以通过检测与其二级结构解体相关的可检测信号来达到对靶向子的检测。

目前常规应用的茎-环状寡聚核苷酸探针以分子信标最为常见。分子信标的序列组成包括环部和茎部序列，并通常在茎部末端的对称碱基标记上一对符合荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)规则的报告基团和淬灭基团。分子信标的环部是靶分子识别区，环部则是维持热力学稳定性的结构。当反应体系中存在靶分子时，分子信标的环部与靶分子发生杂交反应，并且，这种杂交反应能使茎部解体成单链分子，从而使标记在茎部末端的报告基团和淬灭基团的空间距离增大，导致报告基团不再受淬灭基团的影响而发出荧光。但是，由于这种茎-环状寡聚核苷酸的靶分子识别区的初始状态为单链形式，因此，它与靶分子结合的特异性有待进一步提高；此外，由于茎部序列较短，从而使它的热力学亚稳定性较低，因此，设计难度很高，对靶分子的序列组成也有一定的特殊要求，从而在一定程度上限制了应用范畴。

发明内容

本发明要解决的技术问题是进一步提高茎-环状寡聚核苷酸探针的特异性和设计的简便性。本发明解决上述技术问题的技术方案是，

一种茎-环状寡聚核苷酸探针，该探针具有茎-环状二级结构的初始状态，由环部和茎部构成，茎部是两段互补的碱基序列通过氢键结合形成的发卡结构，与靶分子特异性结合的识别区主要由探针的茎部序列组成；当反应体系中没有靶分子存在时，所述的识别区以初始状态的发夹结构存在；当反应体系中有靶分子存在时，靶分子与所述的识别区特异性结合时，茎部的发卡结构解体，同时探针或靶分子产生可检测的信号差异。

本发明探针还可以在茎部的中间或自由端对称地标记有能产生可检测信号的标记物，当茎部的发卡结构解体时能产生信号的差异。

本发明探针还可以在本发明探针的部分或全部碱基标记有能产生可检测信号的标记物，从而可以检测本发明探针-靶分子复合体在形成前后产生信号的差异。

本发明探针可以有多种实现方式：本发明探针既可以由一条单链寡核苷酸通过内部碱基互补结合形成，即单体探针；也可以是存在一定碱基互补关系的两条单链寡核苷酸结合形成茎-环结构，即双体探针；本发明探针的茎部末端可以是平端，也可以是粘性末端。

本发明探针中的靶分子识别区可以全部由茎部序列组成，也可以由茎部和环部序列组成，还可以由茎部和粘性末端序列组成。

构成本发明探针的核酸分子根据不同靶分子的需要，可以全部或部分是核酸、肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)、锁核酸(locked nucleic acid，LAN)或其它类似物，核酸分子上的碱基可以是天然碱基或其类似物；探针的5’-和/或3’-末端可以进行磷酸基团、羟基基团或其它类似基团的修饰或标记。

在本发明中，对所述粘性末端的长度没有特别限制，通常其长度为3～20bp，最佳是4～6bp。

在本发明中，对本发明探针所述环部的长度没有特别限制，通常其长度为3～20bp，最佳是4～6bp。

在本发明中，对本发明探针所述识别区的长度没有特别限制，通常其长度为8～50bp，最佳是15～30bp。

在本发明中，对本发明探针所述茎部的长度没有特别限制，通常其长度为8～50bp，较佳为10～40bp，最佳是15～30bp。