[发明专利]检测DNA甲基化程度的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测DNA序列甲基化程度的方法，以及利用DNA序列的甲基化程度来检测、预后或监测个体中癌症的试剂盒。

发明背景

已熟知肿瘤抑制基因在肿瘤细胞中被甲基化。因而，甲基化标志物已被建议用于检测或监测患者癌症。已有多种方法被提议用于检测这些甲基化的序列。

甲基化特异PCR(MSP)是检测甲基化或未甲基化的DNA最常用的方法。MSP涉及亚硫酸氢盐转化的步骤。用亚硫酸氢钠使胞嘧啶脱氨基成为尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶保持完好。甲基化特异PCR使用靶向亚硫酸氢盐诱导的序列改变的PCR引物，以特异性扩增甲基化的或未甲基化的等位基因。亚硫酸氢盐转化破坏约95％的DNA。由于血清或血浆中DNA的浓度通常很低，DNA减少95％导致检出率小于50％。

其它方法使用特异消化甲基化或未甲基化DNA的限制性内切酶。特异消化甲基化DNA的酶很少。但是，特异消化未甲基化DNA的酶很容易得到。检测方法然后确立消化是否发生，并且因此允许检测所关注DNA是否甲基化或未甲基化(这取决于所用酶的特异性)，其与癌症相关或不相关。

以前已提出过甲基化敏感的酶消化。例如，Silva et al，BritishJournal of Cancer，80：1262-1264，1999进行了甲基化敏感的酶消化及之后的PCR。但是，如作者Yegnasubramanian et al，Nucleic AcidsResearch，Vol.34，No.3，2006e 19所指出的，这些方法被产生的假阳性数所困扰。

本发明寻求提供甲基化敏感的检测的更好方法，其排除或减少假阳性和/或假阴性。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了检测或监测包含至少两个甲基化敏感限制酶识别位点的靶DNA序列的甲基化程度的方法，所述方法包括：

(a)以识别所述甲基化敏感限制酶识别位点的一种或多种甲基化敏感限制酶消化含有所述靶DNA序列的样品；以及

(b)定量消化后所述样品中残留的所述靶DNA序列，

其中步骤(b)中得到的所述靶DNA序列的水平表明所述甲基化程度。

本发明的方法利用甲基化敏感限制酶在多个位点切割靶DNA序列，大大提高了检测的准确性。

相应地，本发明还提供了使用选自来自个体的血液、血浆、血清、唾液、尿的生物样品检测或监测癌症的方法，所述方法包括：

(a)从所述生物样品获得DNA；

(b)使用一种或多种甲基化敏感限制酶消化该DNA样品；

(c)在步骤(b)之后量化或检测靶DNA序列，其中靶DNA序列含有至少两个甲基化敏感限制酶的识别位点；以及

(d)将来自该个体的该DNA序列的水平与正常标准比较，以检测、预测或监测癌症。

在本发明的优选实施方案中，将聚合酶链式反应(PCR)或实时定量聚合酶链式反应(Q-PCR)用于定量靶DNA序列。优选地，该甲基化敏感限制酶识别未甲基化的DNA序列。该靶序列为癌症患者的易被甲基化的序列，因此正常患者的未甲基化的靶序列被消化，不被聚合酶链式反应扩增，而在癌症患者中，靶序列被甲基化并且不被酶消化，随后可被例如使用聚合酶链式反应量化或检测。

本发明的方法可用于预测个体的癌症易感性、评估个体中癌症的阶段、预测个体整体存活的可能性、预测个体的复发的可能性或评估个体中治疗的有效性。

根据本发明的第二方面，提供了检测、预后或监测个体中癌症的试剂盒，包括

(i)至少一种甲基化敏感限制酶；以及

(ii)定量来自所述个体的样品中靶DNA序列的单元，

其中所述靶DNA序列在癌症中表现出异常甲基化模式，并且含有所述甲基化敏感限制酶能识别的至少两个甲基化敏感限制酶识别位点。

在所述癌症为肝细胞癌的本发明优选实施方案中，所述试剂盒优选还包括在样品中定量甲胎蛋白的单元。在所述癌症为鼻咽癌的本发明优选实施方案中，所述试剂盒优选还包括在样品中定量EBV DNA的单元。

附图简要说明

图1显示患者血浆中甲基化的RASSF1A的浓度。

图2显示手术切除肝细胞癌(HCC)后血浆甲基化RASSF1A水平的改变。

图3显示HCC患者中AFP和甲基化的RASSF1A序列的循环浓度之间没有相关性。

图4显示HBV携带者中AFP和甲基化的RASSF1A序列的循环浓度之间没有相关性。

图5显示血浆甲基化RASSF1A的定量分析可以补充用于HCC检测的AFP分析。