[发明专利]一种适用于己烯雌酚残留分析的酶联免疫吸附检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒，具体地说， 涉及一种适用于已烯雌酚(DES)残留分析的酶联免疫吸附检测试剂 盒。

背景技术

人工激素残留常规的分析主要是应用气相色谱(GC)和高效液 相色谱(HPLC)等仪器在实验室进行。应用这些理化分析技术对环 境、生物、食品等样品中痕量已烯雌酚残留进行分析，不仅仪器化程 度要求较高，并且需要经过繁复的分离、提取、净化、衍生等前处理 过程，无法实现大样本的同时检测，对操作人员专业要求较高，前处 理过程需要使用大量的有机溶剂，又造成了新的环境污染。与理化分 析技术相比，酶联免疫吸附分析一般能达到更高的灵敏度。随着待检 样品、特别是要求现场快速检测样品量的迅速增加，传统的分析手段 难以适应要求，因此，迫切需要开发和应用高效率、快速酶联免疫吸 附分析技术。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、 高精确度、操作方法简单的酶联免疫吸附检测试剂盒，用于已烯雌酚 残留的批量、快速检测。

本发明的另一个目的在于提供一种特异性的已烯雌酚单克隆抗 体的制备方法。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供了一种已烯雌酚残留分析的酶联免 疫吸附检测试剂盒，该试剂盒包括包被了已烯雌酚抗原的酶标板、海 绵支架、浓缩洗涤液、已烯雌酚标准品、已烯雌酚单克隆抗体、酶标 二抗、显色液、反应终止液。

其中，包被了已烯雌酚抗原的酶标板的制备过程中，所用的包被 原是已烯雌酚的半抗原正丁酸已烯雌酚单醚(DES-CP)与卵清蛋白 的偶联复合物，所用包被液是0.05M pH9.6碳酸钠缓冲液，所用封 闭液是含1％明胶的上述包被液。

其中，已烯雌酚单克隆抗体的制备过程中所用的免疫原是半抗原 正丁酸已烯雌酚单醚与牛血清白蛋白(BSA)的偶联复合物。

已烯雌酚单克隆抗体的制备方法是用上述免疫原免疫Balb/c雌 性小鼠，再将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤融合，经过多次亚 克隆，筛选到能稳定分泌已烯雌酚单克隆抗体的杂交瘤细胞，该 杂交瘤细胞已于2007年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.1966。采用体内诱 生腹水法，挑选经产Balb/c小鼠，腹腔注射灭菌石蜡油，向预处理后 的小鼠腹腔注射阳性克隆杂交瘤细胞，待7-10天后，小鼠腹部明显 增大，刺穿腹腔，采集腹水。将腹水离心，弃脂肪层和细胞层，收集 中间的澄清层，-20℃保存备用。用35％的饱和硫酸铵盐析法粗提细 胞培养上清和腹水，最后用DE-52阴离子交换层析法进一步纯化，获 得纯化的已烯雌酚单克隆抗体。

其中，酶标二抗是是辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体。

其中，浓缩洗涤液的配方为每20mL蒸馏水中加入氯化钠7～9g、 磷酸二氢钾0.1～0.3g、磷酸氢二钠2～4g、氯化钾3～6g、吐温-200.5～ 3mL。浓缩洗涤液的浓度是正常使用时的50倍。

其中，显色液包括A液和B液，A液配方为每1000mL水中加 入过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8g Na₂HPO₄·12H₂O，吐温-20100μL， pH5；B液配方为每1000mL蒸馏水中加入四甲基联苯胺(TMB) 700mg(40mL DMSO溶解)，10.3g柠檬酸，pH2.4。

本发明试剂盒的检测分析原理是：

酶标板上的每个孔均包被有相同量的抗原，加入待测已烯雌酚样 品和已烯雌酚单克隆抗体后，固相包被抗原和待测已烯雌酚相互竞争 与抗体反应，由于每个孔中的固相抗原和加入的抗体含量均一致，所 以当待测的已烯雌酚浓度高时，则被结合在固相抗原上的抗体少，加 入的酶标二抗与被固定抗体结合量少，用洗涤液洗涤后加入底物液 (即显色液A液)和显色液(即B液)，显色反应浅，用酶标仪检测 的OD值低，表明抑制率高；反之，当待测已烯雌酚浓度低时，则所 测的OD值高，抑制率低。根据用已知的已烯雌酚浓度检测所作的标 准曲线，可以推算出待测已烯雌酚的浓度。

(三)有益效果