[发明专利]一种琼脂糖凝胶微球及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程的生化分离和细胞及其药物载体领域。更具体 地说，本发明涉及一种琼脂糖凝胶微球及其制备方法。

背景技术

琼脂糖是一种从海藻中提取的天然多糖，其水溶液在低温下具有形成 水凝胶的特征。琼脂糖凝胶用作层析介质早在20世纪60年代就已经出 现，它具有理想介质的许多特性：高亲水性、高度多孔性、含较多的可 活化羟基、不与生物大分子发生非特异性吸附^[1]。由于琼脂糖上含有较 多的可活化羟基，在一定的条件下可以接入不同的配基，作为亲和层析、 疏水、反相和离子交换色谱的介质。随着研究与应用的不断深入，琼脂 糖凝胶已实现多种生化物质的快速高效层析分离，分离对象涉及蛋白质、 核酸、肽类、糖类等^[2]-[4]。琼脂糖凝胶除了作为分离介质外，还可以作 为活细胞载体，如Shahab Lahooti^[5]等人采用琼脂糖作为羟乙基丙烯酰甲 酯与甲基丙烯酰甲酯共聚物微球的内核物质包埋HEK细胞，琼脂糖凝胶 的大孔网络结构一方面可以使细胞得到均匀分散，有利于营养物质和代 谢产物的扩散，另一方面也起到了降低微球膜材的浓度，增加膜的通透 性的效果，有利于足够的营养物质进入微球内供细胞生长。研究表明琼 脂糖的加入有利于被包埋细胞活性的保持和细胞的分裂增殖，实验结果 表明与没有琼脂糖相比14天后细胞增殖为其两倍多，这主要是由于琼脂 糖凝胶不仅使细胞分散均匀，而且也起到了为细胞提供一种支持的底物 的作用。Hiroyuki Hayashi^[6]等人采用琼脂糖制备了三层凝胶囊用来包埋 B细胞线MIN6，研究结果表明与未包埋的MIN6相比，胰岛素的分泌速 度增加了1倍多。

目前无论是作为分离介质还是活细胞载体，琼脂糖凝胶微球的制备 方法主要有乳化冷凝法^[7]和喷射冷凝法^[8]-[9]，这些方法由于本身的特征在 制备乳液时不能控制液滴的粒径，所制备的乳液粒径不均一，最终固化 后得到的琼脂糖凝胶微球粒径都不均一。由于粒径不均一，在分离过程 中小的凝胶珠会聚集到大凝胶珠之间的空隙中，使得分离压力增大，严 重时导致分离无法进行。用于细胞包埋时粒径的不均一会使每个微球所 包埋的细胞量不相同，在细胞生长过程中导致扩增速度不相同。另外， 粒径均一的琼脂糖凝胶微球在研究凝胶的基本性质上也具有重要意义， 粒径的不均一会使微球在表征时变得很复杂。另外这些传统的制备方法 不能控制所制备微球的粒径，很难制备粒径小于10微米的微球。

我们曾经采用传统的微孔膜乳化法制备出粒径均一可控的琼脂糖凝 胶微球^[10](以下称为传统膜乳化法制备的琼脂糖凝胶微球)，解决了上述 粒径不均一的问题。该方法可以通过选择不同孔径的膜制备粒径在3—60 微米之间的微球，当制备粒径小于10微米的琼脂糖微球时，所用的膜孔 径非常小，此时即使在较高的氮气压力下乳化速度还是非常慢，增大压 力在一定程度上能提高乳化速度，但太大的压力会降低微球粒径的均一 性，当微球中琼脂糖含量较高时尤其明显。而高琼脂糖含量和小粒径对 于琼脂糖凝胶微球的应用有着很重要的意义。在生物大分子的分离纯化 中，对分离介质的要求是能获得尽可能高的流速和尽可能高的分离效果， 对于在生物分离领域已经广泛应用的琼脂糖介质，这种要求同样存在。 然而琼脂糖的凝胶结构是由氢键相互作用形成的(在凝胶状态，多糖链 通过链间氢键交错连接形成多孔的网状结构)，这种非共价键的结构使形 成的凝胶强度较差。提高琼脂糖凝胶微球强度的途径有两个，其一是通 过化学交联^[11]，即通过在多糖链上的羟基间引入共价键提高凝胶的强度。 在交联效果相同的情况下，另外一条提高凝胶强度的途径是提高凝胶微 球中琼脂糖的含量，即增大水相中琼脂糖溶液的浓度，而琼脂糖水溶液 在浓度增大时粘度也会相应增大。使用传统膜乳化法制备琼脂糖凝胶微 球时，水相粘度的增大给乳液的制备过程带来很大的麻烦，较大的水相 粘度使生成的液滴在膜表面脱落困难，当液滴粒径较小时经过较长的乳 化过程液滴甚至会堵塞膜孔。试验结果表明传统的微孔膜乳化法制备小 粒径高琼脂糖含量的凝胶微球时，较大的水相粘度使制备W/O乳液的过 程即使在压力很大的情况下也很缓慢。

发明内容