[发明专利]一种重金属超富集植物天蓝遏蓝菜遗传转化方法的建立及转基因苗的培育

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域；特别涉及一种重金属超富集植物天蓝遏蓝菜的农杆菌介导的转化以及转基因苗的培育方法。

技术背景

天蓝遏蓝菜(Thlaspi caerulescens)属于十字花科遏蓝菜属，广泛分布于北欧，是一种Zn和Cd的超积累植物。因此天蓝遏蓝菜已成为世界上研究植物对重金属的超累积现象的主要植物之一。天蓝遏蓝菜以其对锌的超富集而称著，同时也是镉和镍的超累积植物。Baker和NcGrath研究发现，土壤含Zn 444mg/kg时，天蓝遏蓝菜地上部Zn的含量可达到土壤的16倍。有文献报道在污染地区和富含矿物质的土壤中生长的天蓝遏蓝菜对锌、镉、镍的累计量分别达到30,000ug Zng^-1d.wt，14,000ug Cdg^-1d.wt，4700ug Nig^-1d.wt。大多数植物累积Zn达到100ppm时即表现中毒症状，而天蓝遏蓝菜可累积Zn达26,000ppm却未表现出任何受伤症状(Brown et al，1995)。随着有关植物重金属富集现象数据的不断积累，已有越来越多的研究者将研究重点转移到植物积累重金属中所涉及的生物化学、分子生物学和植物生理学等研究领域。

拟南芥、烟草等是人们研究新功能基因的主要模式植物。然而，现有的模式植物并不具备对重金属超富集与耐受这样的生理机能。所以，运用分子生物学、基因组学、蛋白质组学等先进的生物学研究技术，发展新的具有重金属超富集和耐受性的模式植物，将使这一领域的研究规范化、深入化，研究结果可比性高，达到事半功倍的效果。

天蓝遏蓝菜虽然具备较好的重金属富集与耐受能力，而且被国内外研究人员看好，但目前尚未出现与其转基因研究相关的报道。本发明旨在提供一种重金属超富集植物天蓝遏蓝菜转基因苗培育方法，建立并基本完善天蓝遏蓝菜的农杆菌转化体系，为其成为具有重金属超富集与耐受的模式植物提供有效技术途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重金属超富集植物天蓝遏蓝菜的农杆菌介导的转化方法以及建立转基因苗的培育，以满足天蓝遏蓝菜转基因研究和生产实际应用的需求。

技术方案如下：

本发明提供了重金属超富集植物天蓝遏蓝菜的根癌农杆菌介导的遗传转化及其转基因苗的培养方法，其步骤如下：

1)建立初代培养物-天蓝遏蓝菜幼苗

取天蓝遏蓝菜成熟种子，用酒精进行表面消毒，置于氯化汞中浸泡后取出；再进行无菌水冲洗，灭菌，并用滤纸吸干其表面水分；

再置于种子萌发培养基上培养7-15天，得初代培养物-天蓝遏蓝菜幼苗；其培养条件为：光照强度为3000-5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20-25℃；

所述种子萌发培养基为MS培养基；

2)天蓝遏蓝菜丛生芽的培养

将上述天蓝遏蓝菜幼苗置于分化培养基上进行丛生芽的分化培养10-14天，至茎节处分化出丛状小苗即丛生芽；其培养条件为：光照强度为3000-5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20-25℃；

所述分化培养基所含组分及配比为：每升分化培养基中含水解乳蛋白300毫克，维生素B0-8毫克，肌醇50-300毫克，蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，以及6-苄基腺嘌呤、萘乙酸两种植物生长激素各0.1-8毫克，pH＝5.8；

所述分化基本培养基为MS培养基；

3)天蓝遏蓝菜丛生芽的预培养

将以上所述天蓝遏蓝菜丛生芽平铺在预培养培养基上进行预培养2-3天；其预培养条件为：光照强度为3000-5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20-25℃；

所述预培养培养基所含组分及配比为：每升预培养基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，维生素B0-8毫克，肌醇50-300毫克，蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，乙酰丁香酮100毫摩尔和激动素、6-苄基腺嘌呤、萘乙酸三种植物生长激素各0.1-8毫克，pH＝5.2；

所述预培养基本培养基为MS培养基；

4)农杆菌的活化

分别挑取带有双子叶植物表达载体的农杆菌单菌落，接种到5毫升LB农杆菌液体培养基中培养8小时；其培养条件为28℃，200转/分；

取培养过夜的LB农杆菌培养液，按1∶40的比例稀释至20毫升LB液体农杆菌培养基中，继续培养5-6小时，至OD₆₀₀为0.6；经5000转/分，离心5min；收集菌体，用侵染液体培养基悬浮沉淀，稀释至OD₆₀₀为0.15侵染液体培养基；备用；