[发明专利]一种在酵母中高效表达sTNFR/Fc融合蛋白的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种在酵母中高效表达sTNFR/Fc融合蛋白的方法及其应用，更具体地说是提供了肿瘤坏死因子可溶型受体和抗体IgG Fc片段的融合蛋白、其高效表达方法和该融合蛋白用于诊断、治疗与瘤坏死因子相关疾病的药物的用途，属于生物工程和医药领域。

背景技术

肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一种前炎症因子，可以通过与细胞表面的TNF-α受体结合，刺激中性粒细胞、成纤维细胞、软骨细胞等表达其他炎性因子(如IL-1β、IL-6、IL-8、白血病抑制因子)和蛋白酶(包括胶原酶、中性金属蛋白酶)。TNF-α也可诱导内皮黏附分子的表达，这些分子导致白细胞和淋巴细胞通过血管壁，向炎症部位聚集，导致许多炎症反应的迁延不愈(Emergingtherapies for rheumatoid arthritis.1998，24(3)：579-591.)。研究表明，TNF-α在多种自身免疫性疾病的发生和发展过程中起了重要的作用(Immunology.1998，10：423-434.)。抑制TNF-α，可能有助于某些相关疾病的治疗。TNF-α在体内主要有两种受体与之结合，介导其生物学活性：TNF受体I(TNF receptor I，TNFRI)和TNF受体II(TNF receptorII，TNFRII)。在某些因素的作用下，TNF受体的N端可从细胞膜上被酶解下来，成为可溶型的TNF受体(soluble TNFR，sTNFR)(Biochemistry.1993；32：3131-3138.)。sTNFR可以与TNF-α结合，从而抑制TNF-α与细胞膜上的TNFR结合，从而阻断其生物活性，可望用于各种TNF-α相关的疾病的治疗。但是单价的sTNFR与TNF-α的结合力较弱。

抗体的Fc片段，由两条相同的肽链，通过绞链区的链间二硫键连接而成的二聚体，它通常包括重链的C_H2和C_H3两个结构域，sTNFR与抗体Fc片段融合后，可望通过Fc片段中肽链间的二硫键形成二聚体，从而提高与TNF-α的结合力。因而sTNFR/Fc融合蛋白具有广泛的用途，但是，sTNFR/Fc是一个糖蛋白，含有多对分子内和分子间二硫键，原核表达系统表达产物没有活性。哺乳动物细胞虽然可以表达具有生物活性的sTNFR/Fc融合蛋白，但哺乳动物细胞具有生长缓慢、培养成本高、大规模培养困难等问题。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是：提供一种sTNFR/Fc融合蛋白及其编码基因。

本发明要解决的第二个技术问题是：提供酵母制备肿瘤坏死因子可溶型受体和抗体IgG Fc片段的融合蛋白(简写为sTNFR/Fc)的方法。

本发明要解决的第三个技术问题是：提供sTNFR/Fc融合蛋白的用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

sTNFR/Fc融合蛋白，其具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或与SEQ ID No.1同源性大于90％的氨基酸序列，采用以下方法制备：

(1)培养含编码该融合蛋白的基因的酵母；

(2)从培养物中纯化制备该融合蛋白。

本发明采用酵母体系表达sTNFR/Fc融合蛋白，具有天然的糖基化位点，利于在人体使用。

编码SEQ ID No.1所示sTNFR/Fc融合蛋白的基因序列，该序列具有序列表SEQID No.2或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。其中序列3为通过人工合成的优化的基因序列，用该序列可以在酵母中获得更高的sTNFR/Fc融合蛋白表达。

人体中有两种肿瘤坏死因子受体分别称为TNF受体I(TNF receptor I，TNFRI)和TNF受体II(TNF receptor II，TNFRII)。各种哺乳动物的肿瘤坏死因子受体具有较高的同源性。在某些因素的作用下，这些受体的N端可从细胞膜上被酶解下来，成为可溶性的TNF受体(soluble TNFR，sTNFR)(Biochemistry.1993；32：3131-3138.)。本发明的肿瘤坏死因子可溶型受体包括上述各种可溶型受体及其同源性大于90％的类似物。