[发明专利]具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白与应用

说明书

技术领域

本发明涉及融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白及其编码基因，以及该融合蛋白的表达方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

癌症是严重威胁人类健康的重大疾病之一。全球新增肿瘤病例每年都在1000万以上，死亡达700多万人，目前，全球肿瘤患者已逾4000万人。据卫生部统计，我国肿瘤发病率呈总体上升趋势，近年来，每年新增肿瘤病人200万，死亡130多万，目前，全国肿瘤患者总数估计约达450万人。

由于传统肿瘤治疗方法(手术切除和放、化疗)的肿瘤靶向性差，毒副作用大，因而肿瘤靶向药物已成为未来抗癌药物发展的重要趋势。特异性抗肿瘤新生血管生成是肿瘤靶向治疗的热点领域。研究表明，肿瘤生长必须依赖其周围新生血管的形成，只要能破坏肿瘤新生血管，肿瘤就会因为无法获得足够的营养而停止生长，并迅速萎缩、凋亡、坏死，最终被机体消除。因此，肿瘤的抗血管治疗提供了针对肿瘤发生、发展过程中多个环节的全新治疗思路，具有良好的应用前景。

血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)是1989年Ferrara等首先在牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中纯化出来的糖类蛋白质，对血管形成具有特异性，并具有促进血管内皮细胞增殖、血管生成、增加血管通透性、加快血液流动等功能。VEGF及其受体家族，尤其是II型受体(F1k1/KDR)，与肿瘤的生长、浸润和转移关系密切，是近年来抗癌药物设计的重要靶标。人类VEGF由于mRNA的不同剪接产生7种不同的VEGF分子，即：VEGF₁₂₁、VEGF₁₄₅、VEGF₁₄₈、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₃、VEGF₁₈₉及VEGF₂₀₆。其中，VEGF₁₂₁是最为常见的VEGF，它包含121个氨基酸残基，与其它成员不同的是，它能与II型VEGF受体(F1k1/KDR)以高亲和力特异结合，而与I型VEGF受体(Flt1)基本不结合。已证实，F1k1/KDR受体具有酪氨酸激酶活性，在多种恶性肿瘤组织的血管内皮细胞表面过度表达，而在相邻正常组织的血管内皮细胞几乎无法检测出。

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)是广泛存在于植物界的一类毒蛋白，是真核生物蛋白合成的抑制剂。它通过RNA N-糖苷酶作用于哺乳动物核糖体大亚基上的28S rRNA，并产生脱腺嘌呤作用，从而破坏核糖体的结构，抑制蛋白质的翻译；同时RIP还参与细胞凋亡的调节，具有巨大的药用潜力。

根据RIP一级结构的不同，可将其分成两类：I型和II型。I型RIP由一条肽链组成；II型RIP由两条多肽链组成，分别称为A链和B链，两条链通过二硫键相连。A链和I型RIP都具有RNA N-糖苷酶活性，能使核糖体失活。丝瓜籽核糖体失活蛋白是I型RIP的典型代表，II型RIP主要包括蓖麻毒蛋白、相思子蛋白和香樟毒蛋白等。I型RIP特别适合做细胞毒性治疗药物的弹头部分，即可将RIP连接到单克隆抗体或者肿瘤抗原的配体上，将RIP带到靶细胞内，选择性地杀死肿瘤细胞，因而具有较高的疗效和较低的毒性。

本发明的发明人从丝瓜籽中获得了一种核糖体失活蛋白，名称为Luffin α，其氨基酸残基序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示，其编码序列可如序列表中的SEQ IDNO：2所示。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有II型VEGF受体特异性，可选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白。

本发明所提供的融合蛋白，命名为VEGF₁₂₁/LuffinKDEL，是通过连接肽在丝瓜籽的核糖体失活蛋白Luffin α的氨基端(N端)连接VEGF₁₂₁的融合蛋白。

所述连接肽的选择是多种多样的，其氨基酸残基序列可如序列表中的SEQ ID NO：3所示的等具有两性分子特征的多肽，能通过破坏靶细胞的溶酶体膜而促进游离的毒素分子在靶细胞的释放，从而增强毒素的杀伤作用。