[发明专利]疏水蛋白的分离提纯方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白的分离提纯方法，特别是涉及疏水蛋白的分离提纯方法。

背景技术

真菌疏水蛋白(hydrophobin)是广泛存在于丝状真菌中的一簇具有不同寻常生理生化性质的小型蛋白质(约含100个氨基酸残基)，在其它有机体中尚未发现。根据疏水性图谱和其组装薄膜的溶解性特征，可将疏水蛋白分为两类：I型和II型。为了更具体的了解疏水蛋白，科学家对它们的结构及生物物理和生物化学等方面的特性进行了大量研究。研究发现，疏水蛋白对真菌类的生长和繁殖起到非常重要的作用，包括真菌对表面的吸附、稳定性，果肉和空中菌丝的形成，以及对真菌结构的覆盖保护等。由水中的菌丝所分泌的疏水蛋白可以在水中扩散且在与其它介质或空气的界面上发生自组装，使水的表面张力大幅下降，从而使得菌丝能够冲破水环境向空气中生长。其中，疏水蛋白SC3可以使50μg/mL水溶液的表面张力从最大72mj/m²降低至24mj/m²，说明疏水蛋白也是很好的表面活性剂。这种蛋白质之所以拥有如此强大的功能，是因为它们具有在亲水-疏水界面上(例如水-空气界面、水-油界面或水与类似特氟龙的疏水性固体界面)通过自组装形成两亲性薄膜的特性。

疏水蛋白大约包含有100个氨基酸残基，通过自组装在界面形成两亲性薄膜从而改变表面的自然特性。疏水蛋白薄膜十分稳固，可以在100℃下抵抗住2％的SDS。疏水蛋白既无细胞毒性也无强免疫原性，因此，它们不仅在生物领域具有很高的科研价值，在医药和工业领域同样具有非常好的应用前景。疏水蛋白可以在固体上面将其它蛋白质固定，或将溶化的蛋白质净化。例如，在医学移植物的表面使疏水蛋白自组装，能显著提高这些移植物的生物相容性或能防止致病的细菌粘附到如导管的表面，并且促进人类纤维原细胞的生长。这种疏水蛋白还可以作为一种媒介，或者称为“粘附剂”，将细胞、蛋白质以及其它种类的分子固定在疏水的固体表面，比如生物传感器。利用组装后疏水蛋白的化学惰性，可以预测在稳定固定酶的活性方面会有优势，同时成型的薄膜具有的多孔性有利于一些小分子进入传感器。在纳米技术领域，经过某些处理的疏水蛋白可以携带不同的功能基团，在表面可以形成纳米精度的不同分子图形，因为组装后的I型疏水蛋白的棒状结构大约只有10nm宽，但化学性质非常稳定。另外，疏水蛋白有非常高的表面活性能(SC3大约是30mj/m²)，与传统的生物表面活性剂十分相似，例如糖脂类、脂肽酶/脂蛋白、磷脂、中性油脂和脂多糖。这样，就可以将疏水蛋白应用于制药业，以替代传统的表面活性剂。

疏水蛋白的这些特性已经引起了科学界的广泛关注，目前的研究主要集中在如何实现其工业化生产及其在各领域中的具体应用方面。但疏水蛋白的生产能力还十分有限，在分离提纯方面也有很大的困难，因而大大阻碍了其发展速度。因此很多国际科技工作者一直致力于此方面的研究，比如de Vocht等人提出的《Method of purifyinga hydrophobin present in a hydrophobin-containing solution》，已于2001年申请了世界范围的知识产权专利保护，公开号为WO/2001/057076。利用疏水蛋白对固体基板的吸附对溶液进行提纯，将固体基板浸入提纯溶液长时间后取出，使用强表面活性剂再将吸附在固体表面的疏水蛋白溶解，最后通过层析法及离心分离法再将疏水蛋白与表面活性剂分离提纯。

我国南开大学在国内杂志《生物活性物质分离与提纯》2005年第31卷第7期上发表的文章《瑞氏木霉疏水蛋白HFBI的分离纯化》，报道了疏水蛋白HFBI的抽提纯化方法，是依次用1％ SDS抽提，KCl沉淀后，经过Berol 532双水相萃取可得到疏水蛋白粗提品，然后再通过Sephadex G-25和Q-Sepharose进一步纯化。

物质中常见的疏水基团有烷基、芳香基等，物质中含疏水性基团越多，其疏水性就会越大，比如聚乙烯，聚苯乙烯，聚丙烯等都属于疏水性物质。特氟龙(Teflon)化学名称叫做聚四氟乙烯，是把乙烯(C₂H₄)中的四个氢(H)都置换成氟(F)，变成四氟乙烯(C₂F₄)，再经聚合作用形成。由于特氟龙是由碳原子和氟原子制成，不含氢，所以疏水性能特别强。特氟龙还具有耐热、耐低温、耐蚀性、优异的非粘着性及自润性、低磨擦系数等特性。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用疏水性物质的粒子对疏水蛋白的吸附及异相成核生长效应对其进行分离提纯的方法。