[发明专利]一种免疫亲和色谱柱及其在净化喹诺酮类药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种用于净化喹诺酮类药物的免疫亲和色谱柱。

背景资料

随着生命科学的发展，人们对生物体内的物质及其变化产生了越来越浓厚的兴趣，而生物样本的分析就成为探索和发现生命奥秘的必要手段。由于生物样本成分复杂，待测物浓度较低，而且大多数取样量很少，这就对分析方法的选择性和灵敏度提出了更高的要求。免疫亲和色谱(Immunoaffinity Chromatography，IAC)是一种将免疫反应与色谱分析方法相结合的分析方法。它的高度选择性和高亲和性无疑使分析过程简化。在兽药残留分析中，IAC最简单而且最有效的应用方式是作为理化测定技术(如HPLC，GC)的样品净化手段，这种联用方法可使免疫学技术和理化技术在选择性、分离能力、速度和灵敏度方面得到互补，并避免了免疫分析法(如ELISA，RIA)直接测定样品的诸多不足。目前，该方法在抗体、激素、多肽、酶、重组蛋白、受体病毒及小分子化合物的分析中被广泛应用。

喹诺酮类药物是近20多年来发展十分迅速的一类抗菌药，因其抗菌谱广、抗菌活性强、半衰期长、高效低毒、使用方便、剂型较多等优点，在国内外人医及兽医临床上普遍用于防治细菌感染性疾病。在我国人医上的应用呈逐年上升的趋势，解放军总医院1995～1999年的抗菌药使用调查资料统计表明，各类抗菌药(含处方药)应用金额构成比例中，QNs药物一直居第2～3位，仅次于头孢菌素和青霉素等β-内酰胺类抗生素；QNs在我国畜禽水产养殖中的应用也是如此，与磺胺类、青霉素类药物共同成为兽医临床上应用的三大类抗菌药。

随着喹诺酮类抗菌药在兽医临床和水产养殖中的应用，其残留问题已引起广泛的关注。QNs残留除了其毒副作用(如对中枢神经系统的影响、药物间的相互作用、光敏性等)对人直接危害外，更为严重的是动物性食品中残留较低浓度的药物容易诱导人类致病菌产生耐药性，从而不利于该类药物在人类疾病的治疗，目前流行病学调查研究发现其耐药菌株正逐年上升，新开发的喹诺酮类药品的市场周期大大缩短。因此，喹诺酮类药物在动物性食品中的残留问题受到极大关注。我国农业部、欧盟、美国等都制定了该类药物在各种动物性食品中的最高残留限量(Maximum residue limit，MRL)。

目前检测喹诺酮类药物(环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹)的方法主要有高效液相色谱法-荧光(HPLC-FLD)、液-质联机(LC-MS-MS)和酶联免疫法(ELISA)等。这些方法的前处理利用液-液分配，常规的SPE柱净化和分离，都在不同程度地存在着处理过程繁琐、净化效果差、有机溶剂浪费多、所需时间长等缺点。免疫亲和技术是上世纪90年代在分析领域得到应用的新技术，但利用免疫亲和柱同时净化生物基质中的环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹等喹诺酮类药物未见报道，更无商品化的IAC柱出售。

发明内容

本发明的目的是提供一种净化喹诺酮类药物的免疫亲和色谱柱。

本发明的免疫亲和色谱柱是由免疫亲和吸附剂为填料装柱而成的；所述免疫亲和吸附剂是由固相载体和与其偶联的喹诺酮类药物单克隆抗体组成；所述喹诺酮类药物单克隆抗体是以喹诺酮类药物半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的。

将诺氟沙星C-7位的哌叮环上的亚氨基用丁二酰氯酰化后再水解得到喹诺酮类药物半抗原，再与载体蛋白偶联得到具有免疫源性的抗原。本发明将喹诺酮类药物用琥珀酸酐酰化，再与载体蛋白偶联得到免疫原。半抗原与载体蛋白的结合比例过低或过高都对免疫不利，半抗原与卵清蛋白(OVA)、牛血清蛋白(BSA)的结合摩尔比分别为31.6∶1和23∶1。

所述固相载体可为纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶等，优选为Sepharose 4B。

所述喹诺酮类药物单克隆抗体优选为对环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-4-3CGMCC No.2066。

所述对环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-4-3CGMCCNo.2066已于2007年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。