[发明专利]核糖核酸及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及核糖核酸及其制备方法与应用。

背景技术

核糖核酸是动物体内一种生物大分子，是一种重要的免疫触发剂或免疫调节剂。1967年通过肉瘤免疫绵羊制取的淋巴细胞核糖核酸对大鼠进行试验，发现核糖核酸能抑制荷瘤鼠肿瘤的生长，甚至消除，首次证实了免疫核糖核酸能传递免疫信息。1982年林单坤等人把从免疫羊肝中提取得到的核糖核酸做成制剂注入体内，发现对肿瘤与癌症有明显的疗效并能提高机体的免疫功能，而且未出现不良的副作用。从脾脏中提取得到的免疫核糖核直接制成针注入体内，可激活人体的T细胞及B细胞的活性；同时有提高人体免疫功能的作用，对一些与人体免疫功能下降有关的疾病，如慢性支气管炎、哮喘病、慢性乙型肝等，以及胃癌、乳腺癌、大肠癌等恶性肿瘤有显著的疗效。虽然免疫核糖核酸在国内已经用于临床治疗，但在生产工艺方面仍然存在一定的问题，给推广带来一定的难度。中国专利CN1116879C曾描述了从牛脾脏制备核糖核酸的方法，受当时条件限制，有些不足：1)由于工艺中使用SDS可能造成残留，并可能使DNA从组蛋白上解离下来，造成DNA含量超标，RNA含量为95-96％左右；2)生产周期过长，生产效率低，整个提取步骤大约需要一周时间；3)收率低，约为1g核糖核酸/公斤胰脏。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产周期短、污染小、成本低、高活性的核糖核酸制备方法。

本发明所提供的核糖核酸的制备方法，包括如下步骤：

1)提取原液的制备

将动物胰腺小块绞碎后移入胶体磨，加入提取缓冲液进行研磨，得到提取原液；

所述提取缓冲液为0.01～0.10mol/L Tris-乙酸缓冲液，pH4～8；

2)核糖核酸的提取

提取原液加入0.2～10倍体积饱和酚液体的上层水相，和0.2～10倍体积的饱和酚液体的下层酚相，加热到40～80℃，恒温30～180分钟；然后，在4～10℃下离心，收集上清液；所述饱和酚液体是将苯酚融化后，加入等体积的步骤1)所述提取缓冲液，搅拌均匀后得到的；

上清液加入0.5～2倍体积的氯仿-异戊醇溶液，摇匀5～30分钟，在4～10℃下离心，收集上清液；上清液加入0.2～2倍体积氯仿-异戊醇，摇匀后在4～10℃离心，收集含核糖核酸的上层上清液，所述氯仿-异戊醇溶液中氯仿与异戊醇的体积比为10～50∶1；

上清液加入0.1～1体积助沉淀缓冲液，再加入2～6倍体积95％乙醇，摇匀，4℃放置过夜，在4～10℃下离心，收集得到核糖核酸沉淀；助沉淀缓冲液为1-5mol/L乙酸钠溶液，pH为3-6。

为了能进一步提高核糖核酸的纯度，减少杂质含量，动物胰腺小块在绞碎前，还要去除非胰腺组织。核糖核酸沉淀还以溶解缓冲液溶解，加乙醇至乙醇终浓度为50～85％，在4～10℃离心；然后，以70-80％乙醇洗涤，并在4～10℃下离心；所述溶解缓冲液为0.5-1M NaCl溶于0.025-0.075M Tris-HCl缓冲液中，pH9.5。在制备过程中，离心的加速度为2000～10000g，优选为4000g。

应用本发明所制备的核糖核酸，还可以制备出一种注射用核糖核酸冻干制剂。

该注射用核糖核酸冻干制剂，是按如下过程制备的：

a)制备注射用核糖核酸中间体

将核糖核酸和右旋糖酐混合，搅拌均匀，控制溶液调节pH值为6.5～7.5，其中，核糖核酸和右旋糖酐的重量比为1∶1～3；然后，加入溶液重量0.1～0.8％的活性炭，混匀、脱色，加注射用水至所需量，使得溶液中核糖核酸浓度为20～30g/L，右旋糖酐浓度为30～60g/L；再依次经孔径为0.3-0.5μm的第一微孔滤膜及孔径为0.1-0.3μm的第二微孔滤膜过滤除菌，得到注射用核糖核酸中间体；

b)病毒灭活

将所得注射用核糖核酸中间体在50～80℃恒温6～12小时，灭活病毒；

c)冻干

将经病毒灭活后的注射用核糖核酸中间体放置冻干箱中，-50至-30℃预冻2～3小时，-30至-20开始升华，真空度≤20Pa；然后，在20-40℃干燥，得到所述注射用核糖核酸冻干制剂。

优选的，第一微孔滤膜的孔径为0.45μm；第二微孔滤膜的孔径为0.22μm。