[发明专利]一种N端特异的人DBF4B多肽及其抗体制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及以抗体为特征的体外试验用的生物制品，具体是一种N端特异的人DBF4B多肽及其抗体制备方法，属于生物医学技术领域。

背景技术

DBF4B(DBF4homolog B isoform 2)是CDC-7类似蛋白1的调控因子，它是一种参与细胞周期调控和基因组复制的丝氨酸-苏氨酸激酶。DBF4B定位于细胞核，其表达受到细胞周期的调控。

发明内容

本发明是为解决通过免疫实验特异性检测人DBF4B的表达与天然存在，并建立相应体外免疫分析所需基本生物制品的问题，而提供的一种能特异性针对人DBF4B的N端的合成多肽、相应抗体及其制备方法。本发明还可同时解决目前使用的类似抗体价格高，亲和力低，抗体结合蛋白的位置不特异且抗原性较差等问题。本发明所述的抗人DBF4B合成多肽、相应抗体，按照以下步骤制备：

抗原表位分析与拮抗位置确定：利用多种表位预测软件，如DNAstar，OMIGA，UWGCG等进行综合分析，主要考量指标包括亲水性结构、抗原指数、表面可及性等，再结合我们已有实际制备抗体的验证经验，最终确定第38到第52位为该抗体的靶标，其氨基酸序列为KNSPGARKHPFSGKS。

多肽的合成：靶标多肽采用全自动多通道多肽合成仪合成，柱层析纯化，然后通过HPLC，用每分钟1％的标准乙晴梯度来检测纯度。

多肽与载体蛋白交联：由于本合成多肽分子量太小，在动物体内不能诱导产生免疫反应，因此将多肽与载体蛋白交联后才能进行免疫，选择钥孔嘁血蓝素进行交联，能显著增加抗原的大小和免疫原性，从而制备出人工免疫原。

免疫动物：所述的制备方法，其抗原肽-交联载体蛋白做为免疫原，免疫家兔制备抗体。选取适龄免疫用新西兰兔，经过适应性饲养后进行多点注射免疫。反复加强免疫，至取血测抗体效价达到标准时停止免疫。

抗体纯化：达到要求的免疫动物放血，标准方法收集抗血清，依次使用辛酸-硫酸铵方法和亲和层析过柱纯化方法，进行抗血清纯化，通过SDS-PAGE和HPLC验证纯度，得到目标抗体。

本发明制备的高质量多肽抗体效价高、亲和力强，可与天然人DBF4B分子发生特异性结合反应。用多肽制备抗体的成本较常规的重组抗原制备抗体方法低，抗体特异性好，经亲和层析纯化后可以用于各种酶免检测和WB试验要求，可用于建立体外免疫分析。该合成肽抗体的制备，为人DBF4B分子的研究及其相关疾病的研究(如诊断策略的制定，流行病学调查、预防和控制)提供了一个重要的工具，以及在生物医学研究中对相应靶蛋白的特性、含量的测定、分布情况的分析和蛋白的确证等方面都具有重要作用。

附图说明

图1是液相色谱鉴定合成多肽纯度结果图。

图2是质谱鉴定合成多肽分子量结果图。

图3是通过ELISA方法鉴定纯化抗体相对亲和常数结果图。

图1表明经过HPLC对合成的多肽进行纯化后，液相色谱鉴定纯度为95.5％。

图2表明多肽分子量理论值为1700，质谱鉴定实测值【M+H⁺】为1701.4。

图3中间接ELISA检测制备的多抗和多肽抗原亲和常数为10⁹-10¹⁰L/mol。

具体实施方式

实施例1：人DBF4B抗原肽的合成。

用DNAstar，OMIGA，UWGCG等蛋白分析软件，对人DBF4B氨基酸序列进行亲水性结构(hydrophilicity)、抗原指数(antigenicity)、表面可及性(surface probability)以及同源性(homology)等分析，再结合我们已有实际制备抗体的验证经验，最终确定第38到第52位为靶标，其氨基酸序列为KNSPGARKHPFSGKS。在全自动多肽合成仪上由固定羧基向氨基端递减合成后获得粗品。经30％乙睛溶解后，进行高压液相色谱(HPLC)分析，计算主峰面积并收集，经冷冻真空抽干后纯化合成肽，质谱鉴定。

实施例2：合成多肽与载体的偶联。