[发明专利]适于精氨酸残基标记的极性敏感荧光探针化合物及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及了一种适于精氨酸残基标记的新型极性敏感荧光探针化合物——3-(4-氯-6-对甲酰甲醛基苯氧基-1，3，5-三嗪氨基)-7-二甲胺基-2-甲基吩嗪，及其制备方法与应用，特别是涉及该化合物在标记蛋白质中精氨酸残基及检测许多酶的活性位点附近的极性的应用。

背景技术

蛋白质分子的结构与功能紧密相关，它的局部错误折叠即可引起与之相关的疾病。因此，发展蛋白质分子的区域结构分析与研究方法(诸如局部信息的获取、折叠或局部构象变化研究等)，将有助于分子水平上认识生命的本质和疾病发生的机理。在研究酶的结构和功能中，活性位点性质和结构的检测也是比较关键的问题。目前，荧光光谱法因具有简便、高灵敏度和高时空分辨能力而成为这一研究领域应用最广泛、最有效的手段之一，构筑和发展各种性能优良的荧光探针及如何实现蛋白特定部位的定位标记则是开展此种研究的前提与基础。

精氨酸残基含有一个强碱性的胍基，在结合带有阴离子的酶活性部位中起着重要的作用，对精氨酸的专一性修饰研究具有重要的应用价值，精氨酸的选择性标记及其用于检测酶活性位点附近结构和性质的研究也是蛋白组学研究中的重要课题之一。目前，精氨酸的选择性标记大多数利用的是二羰基化合物，如苯乙二醛、乙二醛、丁二酮等，文献报道，这些试剂对结合阴离子的活性位点上的精氨酸残基具有高度的选择性(European Journal of Biochemistry，1980，105：387-393)。但这些试剂本身没有荧光，所以不能使用荧光方法对其进行检测。因此，发展用来标记精氨酸残基的荧光试剂非常重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够用于含有精氨酸残基的化合物选择性标记的极性敏感荧光探针及其制备方法与应用。

该荧光探针为3-(4-氯-6-对甲酰甲醛基苯氧基-1，3，5-三嗪氨基)-7-二甲胺基-2-甲基吩嗪，其结构如式I，

(式I)

该极性敏感荧光探针从功能上分，由三部分组成：中性红作为极性敏感基团；三聚氰氯作为桥联剂；苯乙二醛作为标记精氨酸的基团。

该极性敏感荧光探针的制备是利用三聚氰氯分子中的三个氯原子在不同温度下反应活性的差别而实现的：在0～5℃下先取代三聚氰氯的第一个氯原子，在50～70℃下取代第二个氯原子，得到目标产物。具体的，包括如下步骤：

步骤a)：将三聚氰氯与中性红在碱性条件于0～5℃进行反应，得到中间体DTDP；

步骤b)：中间体DTDP与对羟基苯乙二醛在碱性条件于50～70℃进行反应，得到产物3-(4-氯-6-对甲酰甲醛基苯氧基-1，3，5-三嗪氨基)-7-二甲胺基-2-甲基吩嗪。

其中，步骤a)的条件为：pH为8～9，溶剂为丙酮；步骤b)的条件为：pH为8～9，溶剂为四氢呋喃。

本发明荧光探针CGTDP具有以下特点：1)在绝大多数溶剂中荧光性质稳定；2)具有长的荧光发射波长(>550nm)，有利于避免来自普通生物大分子的小于500nm背景荧光的干扰；3)最大荧光发射峰位对环境极性十分敏感，极性增加导致发射波长发生红移，更重要的是，这种漂移只对极性敏感，而不受环境的温度和pH值的影响。因而，该CGTDP探针能在热和酸的变化下对极性进行准确的测定。

CGTDP由于具有上述性质，而且具有适于精氨酸标记的选择性基团—苯乙二醛基团，因此，可广泛应用于含精氨酸残基的化合物分析，特别是，用于含精氨酸残基的蛋白质的分析，这也属于本发明的保护范围。通过对蛋白质上精氨酸残基的选择性标记，从而可以检测被标记基团附近的极性及在不同条件下被标记基团附近区域极性变化情况的测定。

本发明制备出一种能够用于含有精氨酸残基的化合物的选择性标记的极性敏感探针，该探针由于苯乙二醛基团的引入，可以用于含有精氨酸残基的生物大分子的标记及其附近区域极性变化情况的测定和研究，特别是蛋白质中精氨酸残基的选择性标记和精氨酸残基附近极性变化情况的研究。

附图说明

图1为CGTDP在不同溶剂中的荧光发射光谱图；

图2为CGTDP的最大发射波长位移值与溶剂介电常数线性关系图；

图3为CGTDP在不同pH下的荧光发射光谱图；

图4为CGTDP在不同温度下的荧光发射光谱图；

图5为CGTDP、蛋白和CGTDP标记蛋白的紫外吸收光谱比较；

图6为在室温下CGTDP、蛋白和CGTDP标记蛋白的荧光发射光谱的比较图。

具体实施方式