[发明专利]用于多肽融合表达的连接肽及多肽融合表达方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和基因工程领域；更具体的，本发明涉及一种用于目的多肽融合表达的连接肽、利用所述连接肽制备的融合多肽以及制备目的多肽的方法。

背景技术

蛋白质融合表达在基因工程领域中的应用十分广泛，尤其是小分子多肽。研究者们在分离到某一基因后，要对其编码蛋白质进行研究最理所当然的工作就是表达——即：有目的性地合成外源基因产物。在重组DNA技术的发展早期，人们认为在基因的前面有一个强启动子和一个起始密码子就足以在大肠杆菌中获得很好的表达。随后，认识到获得有效的翻译所需的条件要复杂得多，除了要有强启动子和起始密码子外，良好的表达尚需编码目的蛋白的mRNA中含有核糖体结合位点，表达水平受密码子喜好程度的影响，也受编码序列中其它目前尚未明了的因素影响。通过改变起始密码子前端的序列，或者在不改变蛋白质序列的条件下利用密码子的简并性改变5’末端编码序列往往有助于解决问题。

通常，两个基因之间的融合表达能更快地解决这些问题。在这种方式中，目的基因被引入某个高表达蛋白序列(fusion tag)的3’末端，比如大肠杆菌的一段序列，或者任一可在大肠杆菌中高度表达的基因，它提供良好表达所必需的信号，而表达出的融合蛋白的N末端含有由fusion tag编码的片段。fusiontag所编码的可能是整个功能蛋白或是其中的部分。比如6×His Tag、β-半乳糖苷酶融合蛋白和trpE融合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白以及硫氧还蛋白(Trx)融合蛋白等。

在另外的情况下，对小分子的多肽表达通常采用串联融合表达，即将多个多肽基因首尾连接，转入表达载体中进行表达；这样有利于小分子的多肽的高表达，也防止小分子多肽的降解，利于表达后的纯化；采用这种策略表达小分子多肽，可以降低成本、提高目的多肽的得率。因此，在小分子多肽的表达中，融合表达也是经常使用的。

在多肽融合表达中，目的多肽之间及目的多肽和引导肽之间都需要引入连接肽。连接肽是用于切割融合多肽的位点，一般是特异性断裂的氨基酸位点，如Met↓(溴化氰)、Trp↓(BNPS-3-甲基吲哚)、Asn↓Gly(羟胺)、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓(肠激酶)，Lys-Arg↓(Kex2酶)等等。这些特定的切割位点一般在基因表达前已经引入到目的多肽之间，在融合多肽表达后，使用特定的切割方法(化学法或者酶切法)在融合多肽特定的位点断裂融合多肽，从而得到具有生物学活性的目的单体多肽。

多肽串联表达技术的关键是如何加工切除这些目的多肽之间的连接肽，目前仍然没有十分合适的方法。国际上已建立了数种对融合蛋白进行位点特异性裂解的方法，包括化学裂解法和蛋白酶法。其中化学裂解如溴化氰(Met↓)、BNPS-3-甲基吲哚(Trp↓)、羟胺(Asn↓Gly)等，不但便宜且有效，往往还可以在变性条件下进行反应，在早期得到过广泛应用；但由于裂解位点的特异性低，可能对目的蛋白产生的不必要修饰，以及化学物质毒性强，在生产中应用受限等原因，化学法逐渐被反应温和的酶解法取代。

酶解的方法相对来说反应条件较温和，并且具有高度的特异性。其中最为常用的酶有：Xa因子、凝血酶和肠激酶。Xa因子、凝血酶和肠激酶都具有较长的底物识别序列(如在凝乳酶中为7个氨基酸)，从而降低了蛋白质中其它无关部位发生断裂的可能性；其中Xa因子和肠激酶切割后的目的多肽与天然产物完全一致，因此应用范围非常广泛。

在多肽位点特异性裂解方法中，化学裂解法已经渐渐被酶解法取代。国内外对特异性强的蛋白酶的发现越来越多，对这些蛋白酶的研究也越来越深入。